微波-超聲輔助雙水相提取藜麥皮皂苷工藝

楊潔*，高佳麗，辛燕花，鞠韜，趙二勞

1. 忻州師范學院化學系（忻州 034000）；2. 忻州師范學院生物系（忻州 034000）

藜麥（Chenopodium quinoɑWilld.）為藜科藜屬雙子葉一年生草本植物，其種子營養全面而獨特，被聯合國糧農組織認定的唯一一種單體植物即可滿足人體基本營養需求的食物，譽為“未來的超級谷物”和“有機谷類之王”[1]。藜麥原產于南美洲安第斯山區，中國1987年開始引種，現山西、青海、陜西、四川和寧夏等地已規模化種植[2]，資源較為豐富。藜麥皮是藜麥生產加工中的副產品，多被用作飼料或廢棄，既造成資源的浪費，又污染環境。研究表明，藜麥皮中含有皂苷，具有抗氧化、調節免疫[3]、抗炎性[4]、抗腫瘤[5]和抑菌[6-7]等多種功能活性，在醫藥、食品、保健品等領域中具有廣泛的應用前景。因此，研究藜麥皮中皂苷的提取，對于藜麥皮的高值化利用、有效拉長藜麥產業鏈、提高藜麥的經濟價值具有重要的實際意義。

已有一些藜麥皮中皂苷的提取研究報道，如許效群等[8]研究藜麥麩皮中皂苷的乙醇回流提取，楊潔等[9]研究藜麥皮皂苷的微波輔助乙醇提取，但相關研究很不充分，且未見超聲-微波聯合輔助提取的研究報道。基于雙水相體系提取皂苷優勢，研究超聲-微波輔助雙水相提取藜麥皮中皂苷，采用單因素試驗結合響應面法優化其提取工藝，為藜麥皮中皂苷的有效開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥皮（山西華青藜麥產品開發有限公司）。石油醚脫脂后，烘箱中60 ℃烘干，粉碎過60目篩，密封保存備用。

1.2 儀器與設備

XH-200A電腦微波固液相合成/萃取工作站（北京祥鵠科技發展有限公司）；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；V-1100D型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線曲線繪制

參考文獻[10]的方法，準確稱取5.0 mg齊墩果酸標準品，甲醇溶解定容至100 mL，得質量濃度0.05 mg/mL的齊墩果酸標準溶液。分別準確移取齊墩果酸標準溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20和1.40 mL于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，都加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸，加塞搖勻，于70℃水浴反應15 min，取出后用冰水浴冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min。以試劑空白為參比，波長546 nm處測其吸光度。以吸光度A為縱坐標，齊墩果酸濃度c（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A=63.171 4c-0.037 7，R2=0.999 2。

1.3.2 藜麥皮中皂苷測定及測定

準確稱取1.0 g藜麥皮，按試驗設計進行微波-超聲輔助雙水相提取，提取結束后靜置分層，取上清液定容為50 mL。

準確移取一定體積提取液，按1.3.1中方法測定其皂苷濃度，并按式（1）計算皂苷提取率。

標準配送式變電站采用面向間隔與功能的模塊化設計原則，形成“預制艙式二次組合設備+預制式組合二次設備+預制式智能控制柜”的模塊化設計方案[1]。標準配送式變電站站內二次設備模塊主要包括預制艙式二次組合設備、預制式智能控制柜、預制式組合二次設備，其中公用二次設備采用模塊化二次組合設備，布置于裝配式建筑物內；各電壓等級及主變間隔二次設備采用預制艙式二次組合設備，布置于配電裝置場地；合并單元、智能終端等二次設備選用預制式智能控制柜，與匯控柜一體化布置于配電裝置場地[2]。

1.4 單因素試驗

固定其他條件不變，分別考察醇水比值（0.65，0.70，0.75，0.80和0.85）、料液比（1︰30，1︰40，1︰50，1︰60和1︰70 g/mL）、加鹽（磷酸氫二鉀）量（1.5，2.5，3.5，4.5和5.5 g）、微波功率（400，50，500，550和600 W）、微波時間（1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min）、微波溫度（30，40，50，60和70 ℃）、超聲功率（240，280，320，360和400 W）、超聲時間（5，10，15，20和25 min）和超聲溫度（20，30，40，50和60 ℃）對皂苷提取率的影響。

1.5 響應面法優化藜麥皮皂苷提取工藝

根據單因素試驗結果，選取對皂苷提取率影響較大的醇水比值、料液比、加鹽量、微波功率4個因素為自變量，以皂苷提取率（Y）為響應值，采用Design Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗。試驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken響應面試驗因素和水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 醇水比值對皂苷提取率的影響

醇水比值對皂苷提取率的影響見圖1。藜麥皮皂苷提取率隨醇水比值增加而先增后降。醇水比值0.75時，皂苷提取率達最大。這可能與藜麥皮皂苷的極性有關，醇水比值0.75時與藜麥皮皂苷極性相當，有利于皂苷的溶出。因此，選擇醇水比值0.75。

2.1.2 料液比對皂苷提取率的影響

料液比對皂苷提取率的影響見圖2。藜麥皮皂苷提取率在一定范圍內隨著料液比減小而增大，料液比1∶60（g/mL）時，藜麥皮皂苷提取率達最大；料液比小于后，隨料液比減小提取率略有減小。其原因可能是隨料液比減小，溶劑量增大，有利于皂苷的溶出，提取率增大；料液比達到一定值后，藜麥皮中皂苷已基本溶出，再增加溶劑量，也不能增加皂苷溶出量，導致提取率減小。因此選擇料液比1∶60（g/mL）。

圖1 醇水比值對提取率的影響

圖2 料液比對提取率的影響

2.1.3 加鹽（磷酸氫二鉀）量對皂苷提取率的影響

加鹽（磷酸氫二鉀）量對皂苷提取率的影響見圖3。隨加鹽量增加藜麥皮皂苷提取率先增后降。加鹽量3.5 g時，藜麥皮皂苷提取率達最；加鹽量大于3.5 g后，隨著加鹽量增大皂苷提取率減小。其原因可能是加鹽量增加，水相體積增加，使得上相乙醇相濃度增大，有利于皂苷溶出；加鹽量過大時，水相可能產生一定鹽析效應使提取率下降[11]。因此，選擇加鹽量為3.5 g。

圖3 加鹽量對提取率的影響

2.1.4 微波功率對提取率的影響

微波功率對提取率的影響見圖4。微波功率小于450 W，隨微波功率增加皂苷提取率增加；微波功率450 W時，皂苷提取率達最大；微波功率大于450 W后，隨微波功率增大皂苷提取率下降。其原因可能是微波功率過小，皂苷溶出不完全，增加微波功率，有利于皂苷溶出，但微波功率過高會破壞皂苷結構[12]，導致提取率降低。因此，選擇微波功率為450 W。

圖4 微波功率對提取率的影響

2.1.5 微波時間對皂苷提取率的影響

微波時間對皂苷提取率的影響見圖5。微波時間1.5 min時，藜麥皮皂苷提取率達最大。微波時間大于1.5 min后，隨微波時間增加皂苷提取率降低。可能原因是隨微波時間增加，會使部分皂苷氧化降解，導致皂苷提取率降低[13]。因此，選擇微波時間為1.5 min。

圖5 微波時間對提取率的影響

2.1.6 微波溫度對皂苷提取率的影響

微波溫度對皂苷提取率的影響見圖6。藜麥皮皂苷提取率隨微波溫度增加先增后降，微波溫度達到40 ℃時，皂苷提取率最大，之后隨微波溫度增大而減小。其原因可能是微波溫度升高，有利于分子擴散，加快皂苷的溶出，但溫度過高，會使部分皂苷分解，導致提取率下降[13]。因此選擇微波溫度為40 ℃。

圖6 微波溫度對提取率的影響

2.1.7 超聲功率對皂苷提取率的影響

超聲功率對皂苷提取率的影響見圖7。藜麥皮皂苷提取率隨超聲功率增加而增大，超聲功率的增加有利于皂苷的提取。但總體而言，在試驗的超聲功率范圍內，隨超聲功率增大，皂苷提取率變化不大。因此，選擇超聲功率為400 W。

圖7 超聲功率對提取率的影響

2.1.8 超聲時間對皂苷提取率的影響

超聲時間對皂苷提取率的影響見圖8。藜麥皮皂苷提取率隨超聲時間延長增加，超聲時間達到10 min時，皂苷提取率達最大；隨著超聲時間延長而減小。可能是由于超聲時間短，皂苷溶出不完全，提取率低，但時間過程會破壞某些皂苷類成分結構，導致提取率下降[13]。因此，選擇超聲時間為10 min。

圖8 超聲時間對提取率的影響

2.1.9 超聲溫度對皂苷提取率的影響

超聲溫度對皂苷提取率的影響見圖9。藜麥皮皂苷提取率隨超聲溫度升高而增大，在超聲溫度50 ℃時，藜麥皮皂苷提取率達到最大，之后隨超聲溫度升高，過高溫度會破壞皂苷結構，導致提取率降低。因此選擇超聲溫度為50 ℃。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗方案與結果

根據單因素試驗結果，固定超聲功率400 W，超聲時間10 min，超聲溫度50 ℃，微波時間1.5 min，微波溫度40 ℃，選擇對提取影響較大的醇水比值、料液比、加鹽量和微波功率4因素，進行四因素三水平響應面分析試驗。響應面試驗方案與結果見表2。回歸方程的方差分析見表3。

圖9 超聲溫度對提取率的影響

表2 響應面試驗設計與結果

2.2.2 二次多項回歸方程及方差分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，得皂苷提取率（Y）與醇水比值（A）、料液比（B）、加鹽量（C）和微波功率（D）的回歸方程為：Y=5.43+0.020A-0.058B+0.19C+0.062D+0.060AB+0.035AC-0.15AD+0.035BC-0.12BD-5.000E-003CD-0.79A2-0.30B2-0.61C2-0.022D2。

由表3方差分析可知，模型回歸極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），且模型R2=0.988 1，調整相關系數R2Adj=0.976 2，說明試驗誤差小，該模型擬合程度良好，能很好地描述試驗結果。變異系數CV=1.59%，說明試驗操作穩定，可信度高[14]。由各項方差分析結果可知影響藜麥皂苷提取率的因素大小順序為加鹽量＞微波功率＞料液比＞醇水比值，且加鹽量的一次項達到極顯著水平（p＜0.01），料液比、微波功率的一次項達到顯著水平（p＜0.05）；除微波功率外，其他因素的二次項對皂苷提取率的影響均為極顯著（p＜0.01）。表明各因素對皂苷提取率的影響不是簡單的線性關系。

表3 方差分析

2.2.3 各因素交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6軟件作二因素響應面圖，研究影響藜麥皮皂苷提取率的各因素交互作用，結果見圖10～圖15。響應面曲面傾斜度越高，即坡度越陡，等高線越橢圓，交互作用越顯著[15]，顯見，醇水比值和微波功率、料液比和微波功率之間交互極顯著（p＜0.05），這與模型的方差分析結果一致。

圖10 料液比與醇水比值對藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖11 加鹽量與醇水比值對藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖12 微波功率與醇水比值對藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖13 加鹽量與料液比對藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖14 微波功率與料液比對藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

圖15 微波功率與加鹽量對藜麥皮皂苷提取率影響的交互作用曲面圖

2.3 驗證試驗

由Design Expert 8.0.6軟件求解回歸方程，得到微波-超聲協同輔助雙水相提取藜麥皮皂苷最佳工藝條件為：醇水比值0.75，料液比1∶58.30 g/mL，加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率496.23 W。此時藜麥皮皂苷理論預測提取率為5.51%。考慮實際操作的方便性，將最佳工藝條件調整為：醇水比值0.75，料液比1︰58 g/mL，加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率500 W，進行3次平行試驗，測得藜麥皮皂苷平均提取率為5.53%，與理論預測值接近，無顯著性差異（p＞0.05），表明該工藝穩定、可靠。

3 結論

試驗以皂苷提取率為指標，通過單因素試驗結合響應面分析的方法優化微波-超聲輔助雙水相提取藜麥皮皂苷的工藝條件。結果表明，影響藜麥皂苷提取率的因素大小順序為：加鹽量＞微波功率＞料液比＞醇水比值。且加鹽（磷酸氫二鉀）量對藜麥皂苷提取影響極顯著（p＜0.01），料液比和微波功率對藜麥皂苷提取影響顯著（p＜0.05）。響應面法優化的最佳工藝條件為：醇水比值0.75，料液比1︰58.30（g/mL），加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率496.23 W。此工藝下，藜麥皮皂苷理論預測提取率為5.51%。考慮試驗操作的方便性，最終確定的最佳工藝條件為：醇水比值0.75，料液比1︰58（g/mL），加鹽（磷酸氫二鉀）量3.63 g，微波功率500 W。此工藝條件下，藜麥皮皂苷3次平均提取率為5.53%。與理論預測值接近，無顯著性差異（p＞0.05）。表明工藝穩定、可靠。試驗為藜麥皮皂苷的提取應用提供科學依據。