桑黃菌絲精釀啤酒的發酵工藝

許俊齊，謝春芹*，王瑞，黃小忠，張雪松，宋金俤

江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院（句容 212400）

近幾年中國的精釀啤酒呈現出快速發展的趨勢，以多元化、個性化、高端化為特點的精釀啤酒得到大眾的青睞，口味單一、寡淡口味的傳統啤酒不能滿足消費需求。中國精釀啤酒的市場份額約占整個啤酒市場的1%，其發展空間巨大[1]。隨著消費者對健康和飲食品質要求的不斷提高，多樣的口味、健康的品質要求都需推陳出新精釀啤酒的出現[2]。

桑黃菌（Phellinus linteus）又稱桑耳，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）、多孔菌科、木層孔菌屬（Phellinus）真菌，因通常生長在桑屬植物上，子實體顏色鮮黃而得名，是多年生的珍稀藥用真菌，有“森林黃金”之美稱[3-4]。

近年來國內外學者對桑黃的藥理作用及化學成分等方面的深入研究表明桑黃具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗血管生成和抗氧化等多種生理活性[5-7]。由于桑黃特殊的生物特性及外界環境要求苛刻，野生桑黃數量非常稀少，加上人工栽培難度大、周期長，無法滿足人們對珍稀桑黃資源的廣泛需求，這嚴重限制了桑黃應用。桑黃菌人工發酵培養獲取桑黃菌絲體為其產業化開發提供可能，且生產周期短，不受季節和環境的限制，發酵所得菌絲體多糖與子實體多糖功效相當。

試驗將桑黃菌絲液與麥芽汁進行有機結合，不但具有精釀啤酒的諸多特性，也賦予桑黃菌絲多種功效。通過模糊數學評價法對精釀啤酒進行數學化和定量化的描述和處理，減少人為主觀判斷的影響，使評價結果更為科學[8-9]，為此類精釀產品開發和生產提供借鑒及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃菌種（江蘇食用菌研究所）；纖維素酶（食品級，南京松冠生物技術有限公司）；食品級大麥芽（粵海永順泰（寧波）麥芽有限公司）；食品級顆粒酒花哇卡圖（Waktu，山東淄博瑞源生物有限公司）；WB06酵母（法國弗曼迪斯）；啤酒糖漿（青州市華康生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

DBS304-01-30L保溫糖化桶（煙臺帝伯仕自釀酒有限公司）；ZM30L立式自控發酵罐（濟南正麥機械設備有限公司）；WNY-11BF電子溫度計（煙臺帝伯仕自釀酒有限公司）；DBS-20M濾網（煙臺帝伯仕自釀酒有限公司）；WY090R手持折光儀（上海淋譽貿易有限公司）；TMACS-02B分析天平（凱豐集團有限公司）；LHS-150SC型低溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；JMF-3A粉碎機（上海鑫泰機電（集團）有限公司）；SPL-250生化培養箱（天津萊玻特瑞儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 麥芽汁的制備

大麥芽放入容器中加入約麥芽質量5%的水，濕潤表面10 min，使麥麩變軟，用粉碎機粉碎，使麩皮“破而不碎”，麥芽粗細粉比例1︰2.5。

1.3.2.2 麥芽的糖化

參照楊永學等[10]的糖化方法，按料水比1︰4.5（g/mL），在62 ℃條件下保溫50 min，后邊攪拌邊升溫至78 ℃，保持30 min，攪拌升溫至78 ℃，保溫10 min，碘檢至糖化完全。

1.3.2.3 麥醪過濾

糖化完成后，采用濾槽法進行過濾，要求麥汁清亮和麥汁數量多，固形物含量小于30 mg/L。

1.3.2.4 桑黃菌絲液制備

將桑黃菌種接種到斜面培養基上，進行斜面培養；將桑黃菌種接種到搖瓶培養基中，進行一級搖瓶培養，控制轉速190 r/min，28 ℃下培養，15 d后收集菌絲懸液。斜面培養基組成組分為：葡萄糖20 g/L，玉米粉20 g/L，蛋白胨1 g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO4

2 g/L，瓊脂20 g/L。

將經過一級搖瓶培養桑黃菌種的接種到搖瓶培養基中進行二級搖瓶培養。控制條件如一級搖瓶培養。將生產搖瓶二級種接入發酵培養基中，進行擴大培養，得到一級桑黃菌種；一級搖瓶培養條件為接入經過斜面培養的桑黃菌種1.5～2.0 cm2，以轉速150～200 r/min，在20～30 ℃條件下，振蕩培養7～8 d。

將一級桑黃菌種接入裝有發酵培養基的發酵罐中進行發酵罐培養7 d，發酵培養培養基組成為：葡萄糖15 g/L，玉米粉25 g/L，蛋白胨0.5 g/L，麩皮5 g/L，KH2PO42 g/L，Mg SO40.5 g/L。將過濾后的桑黃菌絲，置于60±1 ℃烘干至恒重，粉碎后過30目篩，加入質量百分數為0.7%～1.0%纖維素酶溶液中，在50～60 ℃條件下酶解2～4 h，溶液pH 6.0～6.5，桑黃菌絲與纖維素酶溶液料液比1︰10～1︰15（g/mL），即得桑黃菌絲液。

1.3.2.5 煮沸與酒花的添加

參照楊婧娀[11]的方法。麥芽汁煮沸前添加11%桑黃菌絲液及0.5%啤酒糖漿，煮制期間麥汁保持沸騰狀態，分兩次添加酒花，煮沸10 min添加0.10%酒花，煮沸結束10 min前添加酒花的1/3，即0.05%[10]。

1.3.2.6 回旋沉淀

煮沸結束的麥汁進入回旋沉淀槽中，靜置20 min分離出熱凝固物，糖度計測定麥芽汁濃度，澄清的麥汁進入板式冷卻器中冷卻到10 ℃以下，導入發酵罐中[12-13]。

1.3.2.7 主發酵及二次發酵

參照洪涵煜等[14]及周廣田[15]方法向發酵罐加入已活化的酵母，接種量0.4～0.6 g/L，在恒溫18 ℃密封的環境下進行發酵。發酵期間，當發酵液殘糖不減、比重恒定時，結束主發酵。二次發酵轉入密封罐，加入適量啤酒糖漿，室溫放置5～7 d。移至低溫4 ℃貯藏。

1.3.3 單因素試驗

采用單因素變量控制法進行單因素試驗，以表2感官評定標準為參考依據，研究桑黃菌絲液添加量（5%，7%，9%，11%，13%和15%）、酒花添加量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%）及原麥汁濃度（9，11，13，15，17和19 °P）對桑黃精釀啤酒外觀、口味、泡沫及香氣等感官綜合評分的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以桑黃菌絲液、原麥汁濃度、酒花的添加量為變因，采用四因素三水平L9(34)正交試驗設計方案，以模糊數學評判方法為基準，并根據感官評定結果計算感官綜合評分，優化其發酵工藝參數。桑黃啤酒發酵工藝L9(34)正交試驗因素與水平見表1。

表1 桑黃啤酒發酵工藝L9(34)正交試驗因素和水平

1.3.5 桑黃啤酒模糊感官評定方法

參考GB/T 394.2—2008[16]及GB/T 16291.1—2012[17]，挑選10位經過培訓的品評員（男士5位，女士5位）組成評價小組，要求所有待評啤酒樣品均以透明玻璃杯盛裝，隨機取樣，評定啤酒樣品后要漱口，間隔單位為10 min。

1.3.5.1 模糊數學模型的建立

以桑黃啤酒的外觀、口味、泡沫、香氣為因素集U，以優、良、差為評語集V，根據感官評定結果，建立4個單因素評價矩陣，采用模糊數學法對其進行分析[18]。

1.3.5.2 確定產品因素集U和評語集V

確定桑黃啤酒的產品質量由色澤、組織形態、滋味、香氣4個因素構成，即U=（外觀，口味，泡沫，香氣）；對每個因素的評價按優、良、差3個等級評定，即V={優（V1），良（V2），差（V3）}[19]。

1.3.5.3 確定權重

試驗采用調查法確定色澤、組織形態、滋味、香氣各因素的權重[19]。確定各質量因素的權重分別為外觀（0.3）、口味（0.2）、泡沫（0.3）、香氣（0.2），即X=（0.3，0.2，0.3，0.2）。

1.3.5.4 模糊綜合評判總分

模糊關系綜合評判集Y=X×R，其中X為權重集，R為模糊矩陣[21]。設定感官特殊性：優為90分，良為70分，差為50分，可建立感官特殊性數集Z=（90，70，50），則樣品的模糊綜合評判總分為T=Y×Z[22]。

表2 感官評定標準

1.3.6 桑黃啤酒產品微生物及理化指標的測定

參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[16]中相關規定進行檢測總酸、雙乙酰、酒精度等。

采用GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[23]中的計數法，對大腸桿菌進行測定。

2 結果與分析

2.1 桑黃菌絲液添加量對于啤酒感官綜合評價的影響

桑黃菌絲液添加量對啤酒感官評分的影響，見圖1。隨著桑黃菌絲液添加量增加啤酒的感官評分呈現先增大再減少趨勢。桑黃菌絲液添加量11%時，感官評分值達到最高81.7分。菌絲液含量低于11%時，發酵過程中產生的香味不足，啤酒口味過于單薄，故評分較低。過多添加桑黃菌絲液時，進一步改變啤酒的麥芽香和酒花香，使得感官評分降低。

圖1 菌絲液添加量對啤酒感官評分的影響

2.2 原麥汁濃度對桑黃精釀啤酒感官綜合評分的影響

由圖2分析可知，原麥汁濃度13 °P時，口感最佳，啤酒口感清爽，酒體協調，感官評分最高達79.6分，麥香、酒花等香氣協調，口感醇厚。原麥汁濃度大于13 °P，感官評分減小，原因在于較高的麥汁濃度，使得酵母的整體活力和發酵性能發生相應變化，酵母代謝產生的香味物質也發生變化，最終影響酒體的整體感官評分。故分析認為，桑黃精釀啤酒的最佳原麥汁濃度為13 °P。

2.3 酒花添加量桑黃精釀啤酒感官綜合評分的影響

酒花可賦予啤酒良好的口感，使得酒體中香氣更加豐富，口感層次感強、更佳飽滿，但添加量過多或過少將對啤酒感官評分產生不良影響。由圖3分析得出，酒花添加量小于0.15%時，體現不出啤酒的風味，口感較淡，酒花添加量大于0.15%時，啤酒苦味嚴重，消費者難以接受，感官評分較低。酒花添加量0.15%時，感官分值達82.8分，由于其他添加比例，啤酒口味純正，有愉快的復合酒香氣，苦味也較適合，爽口，酒體協調，無明顯異味。

圖2 原麥汁濃度對啤酒感官評分的影響

圖3 酒花添加量對啤酒感官評分的影響

2.4 正交試驗數學模糊評判結果

由表3可知，10名感官評定員對桑黃菌絲液啤酒的感官評價結果并不集中并且存在差異。

表3 桑黃菌絲液啤酒的感官評定結果

2.5 模糊矩陣的建立

以表4的1號樣品為例，外觀評價結果有2人選優，2人選良，6人選差，則R色澤=（0.2，0.2，0.6）、則R口味=（0.1，0.2，0.7）、R泡沫=（0.1，0.4，0.6）、R香氣=（0.1，0.2，0.7）。

將4種評價結果寫成矩陣形式，如：

根據模糊變換的原理，按照Y=X×R，其中X為權重集，R為模糊矩陣。對1～9號樣品進行綜合模糊評判，結果為：Y1=（0.13，0.26，0.64）；Y2=（0.25，0.41，0.34）；Y3=（0.28，0.45，0.27）；Y4=（0.60，0.35，0.05）；Y5=（0.79，0.19，0.02）；Y6=（0.38，0.53，0.09）；Y7=（0.30，0.58，0.12）；Y8=（0.21，0.27，0.52）；Y9=（0.18，0.36，0.46）。

2.6 桑黃精釀啤酒發酵工藝的優化

從表4桑黃菌絲精釀啤酒最佳發酵工藝的正交試驗結果中的R值可知，影響其感官評分的因素主次順序為A＞C＞B，即桑黃菌絲液＞酒花＞原麥汁濃度。依據綜合評分的結果分析可知，優化的工藝組合為A2B2C3，即11%桑黃菌絲液，原麥汁濃度13 °P，0.20%的酒花添加量，制得的桑黃精釀啤酒外觀、口感、風味及香味的綜合值均保持在最高。

表4 桑黃菌絲液精釀啤酒發酵工藝正交試驗結果

對試驗結果進行方差分析，表5數據顯示，在試驗條件下，桑黃菌絲液添加量與酒花添加量對猴頭菇啤酒的綜合感官評分影響顯著（p＜0.05）。

表5 發酵工藝方差分析

2.7 擴大性驗證試驗

獲得的優化方案A2B2C3為試驗第5組試驗，為進一步確認其在實際生產中的可靠性與可行性，以其為條件（桑黃菌絲液11%，原麥汁濃度13 °P，酒花添加量0.20%），進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復3次，經品評后，綜合得分達87.3±0.5分，試驗結果均優于正交試驗的9組試驗組，表明該配方為較佳的桑黃菌絲啤酒的最佳發酵條件。

2.8 桑黃菌絲啤酒理化、衛生指標

由表6分析得出，桑黃菌絲精釀啤酒中的各項指標符合GB 4927—2008《啤酒》中特種啤酒質量要求。此外檢測表明，大腸菌群MPN小于3 CFU/100 mL。桑黃啤酒具有酒液清亮透明、泡沫細膩、略黃、掛杯持久、口感無異味等特點，且伴有淡淡的麥芽香以及酒花香。

表6 桑黃精釀啤酒理化指標檢測結果

3 結論

采用單因素變量控制法，結合感官綜合評分確定桑黃菌絲液、原麥汁濃度及酒花添加量3個因素最優控制量。在此基礎上，通過正交試驗及模糊數學綜合評判的方法，在減少的主觀影響因素的同時，通過確定權重、計算模糊評價分值來比較試驗樣品之間的感官差別，優化桑黃菌絲液精釀啤酒發酵的工藝參數。結果表明，桑黃菌絲液添加量11%，原麥汁濃度控制在13 °P，酒花添加量0.20%，感官綜合得分為87.3分。此方法制得的精釀啤酒在保留桑黃功效成分的同時，其特點為酒體清亮淡褐色，酒花香味濃，泡沫細膩，持泡性強，口感協調，無異香異味。

試驗為精釀啤酒的感官評價提供模糊評判的理論參考，也豐富精釀啤酒的種類，為其相關產品的開發提供借鑒作用。