超高壓殺菌工藝對生牛乳中微生物的影響

馬莉，張杰，任憲峰，鄭利君，俞偉祖*

內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司（呼和浩特 011517）

牛乳是一種富含蛋白質、礦物質等多種人體所需的營養成分及免疫活性因子的食品[1-5]，為了保證食品安全性，天然牛乳必須經過殺菌[6-11]。傳統的熱力殺菌雖然大大提高了產品的貨架期和食品安全性，但對牛乳的營養成分和風味物質破壞相當嚴重[12]，直接影響了產品的質量[13-15]。然而，消費者對優質食品的要求是新鮮、美味、營養，這使得非熱加工技術越來越受到食品工業的關注[16]。超高壓殺菌技術作為一種新型非熱加工技術，不但可以達到熱力殺菌同樣的效果[17-18]，而且可以最大限度地保留牛乳的天然色澤、香氣成分與營養價值[19-20]，同時還能夠增強牛乳蛋白的可消化性。試驗以超高壓處理壓力、保壓時間為因素，菌落總數及大腸菌群數量為指標，研究了超高壓處理工藝對生牛乳中微生物的影響，初步確定生牛乳超高壓殺菌的工藝條件，為超高壓技術在牛乳殺菌中的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳：內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司；BGLB肉湯培養基、PCA平板計數瓊脂培養基（北京陸橋生物技術有限責任公司）；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HPP600MPa-30L超高壓設備（包頭科發高壓科技有限責任公司）；LVG-3_G-F8超凈工作臺（新加坡Esco科技有限公司）；VORTEX1渦旋振蕩儀（艾卡儀器設備有限公司）；NP-30S旋渦混合器（常州恩培儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 超高壓處理工藝

1.3.1.1 超高壓處理壓力對生牛乳中微生物的影響

固定溫度25 ℃、保壓時間15 min，壓力分別選取100，150，200，300，350，400，500和600 MPa處理生牛乳，以未經超高壓處理的鮮牛乳作為空白對照組，檢測處理前后樣品中的菌落總數和大腸菌群數量。

1.3.1.2 保壓時間對牛乳中微生物的影響

固定壓力400 MPa、溫度25 ℃，采用不同保壓時間5，10，15，20，30和40 min處理生牛乳，空白對照組為未經超高壓處理的生牛乳，檢測處理前后樣品的菌落總數和大腸菌群數量。

1.3.1.3 超高壓處理工藝條件優化

在超高壓處理壓力和保壓時間單因素試驗的基礎上，優選出最佳處理壓力和保壓時間，進行正交試驗，以未經超高壓處理的生牛乳作為空白對照組，對超高壓處理后的樣品進行菌落總數和大腸菌群數量的測定，篩選微生物致死率較高的壓力、時間組合。

1.3.2 微生物的檢測

按照GB/T 4789.2—2003和GB/T 4789.3—2003測定。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理壓力對生牛乳中微生物的影響

在保壓時間15 min、溫度25 ℃條件下，對生牛乳進行不同壓力的滅菌，每個處理重復3次，取平均值。處理壓力對生牛乳中菌落總數的影響如圖1和表1所示。在低壓處理條件（100～300 MPa）下，菌落總數相比鮮牛乳中的初始菌數（1.2×105CFU/mL）有所增加，致死率為負數。隨著壓力的增加，菌落總數呈顯著下降趨勢，當壓力達到400 MPa時，殘留菌數為7.4×103CFU/mL，致死率達93.8%；當壓力達到500 MPa時，殘留菌數為4.7×103CFU/mL，致死率達96.1%；當壓力達到600 MPa時，殘留菌數為1.5×103CFU/mL，致死率達98.8%。生牛乳中的大腸菌群隨著壓力的增加一直呈顯著下降趨勢，當壓力為150 MPa時，大腸菌群數由初始的4.5×103CFU/100 mL降低至＜1 CFU/100 mL，大腸菌群呈陰性。綜合超高壓設備的使用壽命及殺菌效率，在殺菌效率達到96%以上的情況下選擇壓力進行保壓時間單因素試驗。因此，選擇進行保壓時間單因素試驗的處理壓力為500 MPa。

圖1 不同壓力處理生牛乳15 min后對殘留的菌落總數的影響

表1 不同壓力處理生牛乳15 min后微生物的結果

2.2 保壓時間對生牛乳中微生物的影響

在處理壓力500 MPa、溫度25 ℃的條件下，對鮮牛乳進行不同保壓時間的超高壓處理，每個處理重復3次，取平均值。保壓時間對菌落總數的影響見圖2和表2。由圖2可知，在處理壓力500 MPa下，隨著保壓時間的延長，殺菌效率呈顯著性提高，當保壓時間達到20 min以后，殺菌效率的增長速率下降，趨于緩慢提高，說明當殺菌效率達到一定值后，僅通過保壓時間的延長不能達到完全殺滅細菌的目的。但對于大腸菌群而言，在500 MPa壓力下保壓5 min即可被完全殺滅。

圖2 500 MPa壓力下處理生牛乳不同時間對殘留菌落總數的影響

表2 500 MPa壓力下處理生牛乳不同時間后微生物的結果

2.3 超高壓處理工藝條件優化

綜合上述壓力和時間的單因素試驗，選擇兩者作為影響因素，同時由于低壓力有利于鮮牛乳中芽孢的激活，而高壓力有利于細菌的殺滅，因此將低壓力、低壓保壓時間、高壓力和高壓保壓時間作為超高壓殺菌效率的影響因素，選用L9(34)正交表進行試驗設計，每個處理重復3次，取平均值，以未經超高壓處理的樣品作為空白對照，經超高壓處理后的樣品進行菌落總數和大腸菌群數量的測定。因素水平設置見表3，結果及方差分析見表4和表5。

表3 L9(34)因素水平表

表4 超高壓殺菌乳最優工藝參數正交試驗結果

表5 正交試驗菌落總數結果方差分析

由表4中菌落總數的相關數據，分析k值可知，最優工藝組合為A3B1C3D2，即低壓200 MPa，低壓保壓時間5 min，高壓500 MPa，高壓保壓時間30 min。分析R值可知，4個因素對微生物殺滅作用影響的大小依次為高壓＞高壓保壓時間＞低壓＞低壓保壓時間，且高壓、高壓保壓時間這2個因素對于超高壓殺滅微生物的效果有顯著性影響。在此最優工藝組合條件下對生牛乳進行超高壓滅菌，菌落總數由處理前的1.2×105CFU/mL降低到處理后的100 CFU/mL，致死率達到99.92%，此時大腸菌群被全部殺滅。

3 結論

單因素試驗中，處理壓力在一定范圍內，隨著壓力的增大，菌落總數和大腸菌群數量的致死率呈上升趨勢，但當壓力超過一定范圍后，處理壓力的繼續增加對殺菌效果的影響趨于平緩，趨勢不顯著；保壓時間也影響超高壓對鮮牛乳中微生物的殺滅效果，延長保壓時間，菌落總數和大腸菌群的致死率呈顯著上升趨勢，但當時間超過一定范圍后，對滅菌效率的影響趨于平緩，呈不顯著上升趨勢。

超高壓殺菌工藝的正交優化條件為A3B1C3D2，即低壓200 MPa，低壓保壓時間5 min，高壓500 MPa，高壓保壓時間30 min。

綜上所述，研究采用超高壓殺菌技術殺滅生牛乳中的微生物，處理后的牛乳中菌落總數和大腸菌群殘留量很少，殺菌效果較好，但僅優化壓力和時間兩個參數，不能使最終殺菌效果達到商業無菌的要求，因此在后續的研究中需要對超高壓殺菌的其他參數比如溫度進行進一步研究，綜合考量各參數的最優指標及組合，為鮮奶產品的生產提供參考。