響應面法優化藜麥種子中多酚提取工藝

游新勇，崔利華，周亞麗*，李瓊，張進

安陽工學院生物與食品工程學院（安陽 455000）

藜麥（Chenopodium quinoɑ Willd），藜科藜屬植物，最早種植于南美洲的安第斯山區，具有特征性的高遺傳變異性，為不同地點和氣候條件下的生長提供必要的抵抗力[1-3]。由于藜麥的營養價值很高，在其他國家也廣泛引種種植。20世紀，我國西北地區開始引進藜麥，隨后在青海、山西、甘肅、內蒙古等高海拔地區廣泛種植。2017年，我國的藜麥種植面積超過9 000 hm2，每年的藜麥產量超過1.76萬 t[4-5]。

與普通谷物不同，藜麥是大量營養元素的極好來源，特別是含有大量蛋白質和必需氨基酸。此外，藜麥還是維生素、礦物質等微量營養元素[6-9]和酚類化合物[10-11]的良好來源。這些化合物具有很強的體外抗氧化能力，可預防癌癥、過敏、炎癥和心血管疾病等疾病發生[10,12-13]。近年來，由于功能性食品具有降低疾病的風險并發揮了促進健康的作用，人們對這些新產品的興趣日益增加。藜麥的營養和開發利用價值也在最近幾十年得到廣泛認識和重視[14]。

藜麥中含有豐富酚類物質，如多酚、黃酮、皂苷等，這些化合物具有藥理學特性，可作為開發新功能性食品的主要成分[15]。有研究表明，藜麥多酚的含量與抗氧化力有關，而且藜麥中大部分多酚化合物在體外仍具有生物活性[7,16-17]。同時，研究發現，藜麥葉片的提取的酚類物質，具有很強地抗氧化活性、單體酚還可以抑制癌細胞的增殖[18-19]。但藜麥種子中多酚物質的提取工藝及深入研究還鮮見報道。

試驗采用乙醇作為提取劑提取藜麥多酚，以沒食子酸為標準品，使用福林肖卡比色法測定藜麥多酚的得率。采用單因素試驗和響應面法優化藜麥多酚提取工藝，對藜麥多酚深入的科學研究及藜麥產品的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青海藜麥（2018年購于山東老鄉生態農業有限公司，4 ℃保存）。

無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司）；沒食子酸（上海麥克林生化試劑有限公司）；福林酚試劑（國藥集團化學試劑有限公司）；無水碳酸鈉（天津市北辰方正試劑廠）。試劑均為分析純。

電熱鼓風干燥箱（HDG-9240，上海一恒科學儀器有限公司）；藥材粉碎機（FW-2，浙江武義屹立工具有限公司）；離心機（H1850，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；紫外光可見光分光光度計（T9，北京普析通用有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藜麥提取液的制備

選用新鮮且較飽滿的青海藜麥種子為原料，清洗干凈去除雜質、麩皮，干燥后采用粉碎機制粉。粉碎后用80目篩子篩分后得藜麥粉末，干燥避光保存。

準確稱取1.00 g研磨好的藜麥粉末放入燒杯，加入提取溶液，設定超聲波功率，進行提取。超聲波提取過后將提取液用蒸餾水定容至50 mL，離心（3 500 r/min，10 min），測定740 nm吸光度，計算藜麥粉末中多酚的得率，確定最佳的提取條件。

1.2.2 超聲波提取藜麥多酚的單因素試驗

1.2.2.1 提取時間的確定

準確稱取6份1.00 g藜麥粉末，設置時間梯度范圍10～60 min，每組間隔為10 min，加入體積分數60%乙醇，料液比1︰20（g/mL），提取溫度60 ℃，超聲波功率200 W條件下提取，將提取液定容至50 mL，離心，取上清，測定740 nm處吸光度，計算多酚得率。

1.2.2.2 料液比的確定

稱取5份1.00 g藜麥粉末，設置料液比梯度1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30（g/mL）。加入體積分數60%乙醇，溫度60 ℃，超聲波提取功率200 W，提取30 min。將提取液定容至50 mL，離心，取上清，測定740 nm處吸光度，計算多酚得率。

1.2.2.3 乙醇體積分數的確定

取5份1.00 g藜麥粉末，分別用體積分數40%，50%，60%，70%和80%乙醇，料液比1︰20（g/mL），溫度60 ℃，功率200 W，提取30 min。離心，取上清，測定740 nm處吸光度，計算多酚得率。

1.2.2.4 響應面法優化藜麥多酚的提取工藝

根據單因素試驗結果，依據Box-Behnken中心試驗設計原理設計響應面試驗[20-21]。藜麥多酚的提取得率為響應值，并將提取時間（A）、料液比（B）、乙醇體積分數（C）作為自變量，優化其提取工藝。自變量的試驗水平用-1、0、1作為編碼，共設計15個試驗點，其中12個作為析因點，3個為區域的中心零點，用來估計試驗誤差[22]。試驗因素和水平見表1，試驗設計方案見表2。并用Minitab和Design-Expert軟件進行對試驗數據進行回歸方差分析，得出其最優提取工藝。

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.3 藜麥總酚含量的測定[23]

準確吸取藜麥粉末提取液1 mL，放入10 mL比色管中，加入0.5 mL福林酚，靜置反應1 min，加入1.5 mL 10% Na2CO3，定容到刻度線，搖勻，避光靜置1 h，取出，在740 nm處測定吸光度。根據回歸方程計算藜麥多酚質量濃度c，根據式（1）計算藜麥多酚得率。

式中：c為多酚質量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數；w為投料量，g。

標準曲線的制備：配置30 μg/mL沒食子酸溶液，分別吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL，于10 mL的比色管中，加入0.5 mL福林酚試劑，靜置1 min，加入1.5 mL 10% Na2CO3溶液，定容，搖勻，避光靜置1 h，在740 nm處測定其吸光度。吸光度作為縱坐標，溶液質量濃度為橫坐標，繪制回歸方程y=0.094 6x+0.113 3（R2=0.995 9）。

1.3 數據處理

試驗所得的數據使用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0軟件分別進行數據計算和顯著性分析（p＜0.05），使用Origin 2016軟件繪圖，采用Minitab和Design-Expert軟件進行響應面分析。所有的數據均為3個重復的平均值±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 藜麥多酚提取工藝參數的確定

2.1.1 提取時間對藜麥多酚得率的影響

由表2和圖1可知，提取時間在10～30 min范圍內，藜麥多酚得率逐漸增大；提取時間到30 min時，藜麥多酚得率最大；隨著提取時間增加，藜麥多酚得率顯著下降。因此，選擇最佳的提取時間30 min。

表2 提取時間對藜麥多酚的影響

圖1 提取時間對藜麥多酚得率的影響

2.1.2 料液比對藜麥多酚得率的影響

由表3和圖2可知，隨著提取溶劑體積增大，料液比升高，藜麥多酚得率逐漸增大，料液比1︰20（g/mL）時，藜麥多酚得率達到最大值，顯著高于其他組（p＜0.05）；但隨著料液比增加，藜麥多酚得率顯著降低。因此，選擇最佳料液比1︰20（g/mL）。

2.1.3 乙醇體積分數對藜麥多酚得率的影響

乙醇價格低廉，無毒，選擇性好，極性較高，對酚類物質有較高的溶解度。由表4和圖3可知，在其他提取工藝相同的條件下，乙醇體積分數在40%～60%范圍內，藜麥多酚得率逐漸增加，并在乙醇體積分數60%時，藜麥中多酚得率達到最大值；之后隨著乙醇體積分數增加，藜麥多酚得率顯著下降，這是由于在植物體內，多酚物質以氫鍵結合蛋白質、多糖類物質完成傳質過程，而高濃度乙醇會引起植物體內蛋白質變性，阻止多酚物質的傳質過程，降低多酚的提取量[24]。因此，選擇最佳的乙醇體積分數60%。

表3 料液比對藜麥多酚的影響

圖2 料液比對藜麥多酚提取得率的影響

表4 乙醇體積分數對藜麥多酚的影響

圖3 乙醇體積分數對藜麥多酚提取得率的影響

2.2 響應面分析法優化藜麥多酚提取工藝

2.2.1 響應面優化試驗結果

通過Design-Expert分析軟件對藜麥提取條件進行優化試驗設計及分析，響應面分析見表5，方差分析結果見表6。

通過多遠回歸分析，得到二次多項式擬合方程為Y=0.23-3.250×10-3A+2.0×10-2B-5.5×10-3C+2.5×10-4AB-7.5×10-4AC-5.25×10-3BC-0.015A2-0.019B2-0.011C2，其中，Y為藜麥多酚得率，A為提取時間（min），B為料液比（g/mL），C為乙醇體積分數（%）。方程中，各項系數絕對值的大小和正負，分別反映各單因素對響應值的影響程度和影響方向[25]。

方差分析結果，如表6所示，多元二次模型p＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項p=0.039 2＜0.05，說明回歸模型顯著；相關系數R2=0.987 9，說明該方程擬合度較好，可用該模型預測藜麥多酚得率。顯著性檢驗結果表明，A、C、A2、B2、C2極顯著影響藜麥多酚得率（p＜0.01），三因素兩兩交互中BC項p＜0.01，說明料液比和乙醇體積分數兩因素的交互作用對藜麥多酚得率的影響極顯著；而B、AB、AC項對藜麥多酚得率影響不顯著（p＞0.05）。各因素對藜麥多酚得率的影響次序依次為乙醇體積分數（C）＞提取時間（A）＞料液比（B），即乙醇體積分數對藜麥多酚得率的影響程度最大。

表5 響應面分析試驗結果

表6 方差分析結果

根據回歸方程，繪制響應面。由圖4（a）可知，乙醇體積分數處于0水平時，提取時間與料液比的交互作用較弱。比較圖4（a）和圖4（c）可知，說明乙醇體積分數對藜麥多酚得率的影響比提取時間大；由圖4（b）和圖4（c）可知，提取時間對藜麥多酚得率的影響比料液比大，這與方差分析的結果一致。

圖4 兩因素交互作用對多酚得率的響應面圖

2.2.2 最佳提取工藝條件的確定

根據回歸方程計算，最佳的提取工藝參數為：提取時間31 min，料液比1︰20.45（g/mL），乙醇體積分數57.2%。如表7所示，在此工藝條件下，藜麥多酚的最大提取得率百分比為0.227%。為了方便試驗的進行，最終確定最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數60%，料液比1︰20（g/mL），提取時間30 min，并在這個條件下進行3次相互平行試驗，結果表明，藜麥多酚的提取得率為0.227%，試驗結果與Minitab和Design-Expert軟件設計最優的設計模型預測值相近，說明試驗設計的模型，預測的試驗參數比較精準，證明結果合理可靠。

表7 藜麥多酚的最優提取工藝

3 結論

通過單因素試驗和響應面法優化提取工藝，確定提取時間30 min、料液比1︰20（g/mL）、乙醇體積分數60%為最佳工藝條件，該條件下藜麥多酚得率最大為0.227%，與預測值誤差在1%內，得到的回歸方程合理可靠，具有一定可行性。試驗結果優化藜麥多酚的提取工藝，對藜麥功能性食品研發具有指導意義。