響應面優化微波輔助離子液體提取葛根素的工藝

黎莉，于德涵，蘇適，王廣慧

綏化學院食品與制藥工程學院（綏化 152061）

葛根[Puerɑriɑ lobɑtɑ（Willd.）Ohwi]為豆科植物野葛的干燥根[1-2]，我國葛根植物資源豐富，具有數量、質量等經濟價值的優勢，是我國傳統的天然中藥材[3]，富含淀粉、氨基酸、植物蛋白，黃酮類物質和維生素等成分。葛根中主要活性成分是葛根素，其化學本質屬于異黃酮類化合物[4]具有較高的藥用價值和保健作用，研究表明葛根素對心腦血管疾病[5]、抗炎癥[6]、肥胖[7]和微循環障礙[8]等都具有一定的治療和改善效果。因此，葛根素的含量可以作為葛根提取物的質量評價指標。

傳統提取葛根素的方法存在耗時長、工藝復雜、溶劑用量大、純化難等缺陷。微波輔助萃取法是提取天然產物的有效方法，微波具有較強的穿透和加熱能力，能促進細胞內部大量產熱導致細胞壁破裂，顯著提高細胞內成分的溶出速度，縮短提取時間，產品易純化，并能有效保護天然產物功效[9]。傳統的微波萃取法一般選用甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙醚等有機溶劑，傳統溶劑有較強的揮發性或毒性，給天然產物的提取和利用帶來了極大的不便和環境污染問題。離子液體（ionic liquid）是一種新型的綠色溶劑，與傳統有機劑相比，溶解能力強，熱穩定性好、化學性質穩定、不易揮發且可重復利用[10-11]，能溶解纖維素并破壞植物細胞壁，并能很好的吸收微波輻射。因此，研究利用離子液體結合微波輔助提取葛根中的葛根素，通過響應面試驗優化葛根素的提取工藝。目前，葛根的應用主要集中于食品原料的粗開發，產品附加值較低，制約了葛根資源的開發和利用，針對葛利用提供一個高效、快捷的提取方法，并能保持葛根素的活性和產品純度，為合理開發葛根資源提根素的提取方面的研究較少，該研究為葛根素的有效供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葛根：北京同仁堂參茸中藥制品有限公司。

葛根素標準品，純度98%，北京中科質檢生物技術有限公司；[Bmim]Cl（1-正丁基-3-甲基咪唑氯），純度97%，國藥試劑有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析純，國藥試劑有限公司；抗壞血酸，分析純，國藥試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器與設備

MKX-E1微波萃取儀，青島邁可威微波創新科技有限公司；TDZ5-WS離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；DZF-6050E真空干燥箱，無錫瑪瑞特科技有限公司；UV1800PC紫外分光光度計，上海向帆儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線

根據文獻[12]方法，稱取葛根素對照品5 mg，加少量乙醇溶解并加蒸餾水于50 mL容量瓶中定容，配制成0.1 mg/mL的葛根素標準溶液。移取標準溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.5和2.0 mL分別置于10 mL容量瓶，用95%乙醇定容至刻度線。在250 nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標、質量濃度C（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得到葛根素標準曲線方程為：X=6.820 6Y+0.210，R2=0.996 8。

1.2.2 葛根素的提取工藝及含量測定

葛根洗凈→60 ℃烘干→粉碎→過60目篩→稱取1.0 g葛根粉→微波輔助[Bmim]Cl的水溶液提取（40℃）→葛根素提取液離心（30 min，3 000 r/min）→取上清液→測定葛根素含量。

式中：R為葛根素提取率，%；C為測得質量濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數；M為原料質量，g。

1.2.3 單因素試驗方法

單因素試驗依次考察離子液體濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mol·L-1）、料液比（1︰5，1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30 g·mL-1）、提取時間（2，4，6，8，10和12 min）、微波功率（100，200，300，400，500和600 W）4個因素對葛根素提取率的影響結果，平行進行3次試驗，在250 nm處測定吸光度，計算葛根素提取率。1.2.4 響應面優化試驗方法

結合單因素試驗結果，以葛根素的提取率為響應值（Y），進行Box-Behnken試驗設計。選取離子液體濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）4個變量，設計響應面試驗，具體因素與水平設計見表1。

表1 微波輔助離子液體提取葛根素Box-Behnken因素設計與編碼

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 離子液體濃度對提取率的影響

固定微功率350 W、提取時間 10 min、料液比1︰15 g/mL，分別在不同離子液體濃度下進行提取，確定響應面試驗離子液體濃度的優化范圍，結果見圖1。

隨著離子液體濃度的增加，葛根素提取率明顯升高，當[Bmim]Cl濃度高于1.0 mol/L時，葛根素提取率開始下降。可能是離子液體濃度低，溶劑與葛根素類化合物接觸的概率小，故提取率低；但[Bmim]Cl濃度不斷增加會導致溶劑體系的黏度增大，降低溶劑滲透到植物組織的能力，阻礙了葛根素在溶液中的擴散[13]。因此，選擇離子液體濃度0.8，1.0和1.2 mol/L作為響應面試驗考察條件。

圖1 離子液體濃度對提取率的影響

2.1.2 微波功率對提取率的影響

固定離子液體濃度1.0 mol/L、提取時間 10 min、料液比1︰15 g/mL，分別在不同微波功率下進行提取，確定響應面試驗微波功率的優化范圍，結果見圖2。

圖2 微波功率對提取率的影響

隨著微波功率的增大，葛根素的提取率先增大后降低，當微波功率達到400 W時，葛根素提取率達到最大值，隨后開始下降。可能是微波功率過小，無法充分破壞葛根植物，葛根素不能完全釋放出來；微波功率過高也會加速植物細胞內其他雜質的溶出，葛根素提取率降低[14]。因此，微波功率選擇350，400和450 W作為響應面試驗考察條件。

2.1.3 料液比對提取率的影響

固定離子液體濃度1.0 mol/L、微波功率400 W、提取時間10 min，分別在不同料液比下進行提取，確定響應面試驗微波功率的優化范圍，結果見圖3。

葛根素提取率隨著料液比的增長而顯著增加，當料液比為1︰20（g/mL）時，葛根素的溶解度和溶出速度達到最大，隨后開始下降。可能是料液比過小，提取液粘度較大，不能保證葛根素轉移到提取液中。料液比增大，大量溶劑會吸收一定的微波輻射，降低了細胞內葛根素溶出量[15]。因此，料液比選擇1︰15，1︰20和1︰25 g/mL作為響應面試驗考察條件。

2.1.4 提取時間對提取率的影響

固定離子液體濃度1.0 mol/L、微波功率400 W、提取時間10 min，分別在不同料液比下進行提取，確定響應面試驗提取時間優化范圍，結果見圖4。

圖3 料液比對提取率的影響

圖4 提取時間提取率的影響

提取時間在2～12 min時，葛根素提取率隨著時間的延長迅速增加，提取8 min時，提取率達到最大值，隨后開始下降。可能是提取時間短，葛根中有效成分不能充分溶出；提取時間過長，微波產生高溫破壞有效成分[16]。因此，微波時間選擇6，8和10 min作為響應面試驗考察條件。

2.2 響應面優化葛根素提取率的最佳工藝參數

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗

對表2數據進行二次多項式回歸擬合，獲得葛根素提取率得與離子液體濃度、微波功率、料液比、提取時間4個因素的回歸方程為：Y=+4.22+0.068A+0.024B+0.065C-0.030D-7.250×10-3AB+3.500×10-3AC-4.75×10-3AD+0.018BC+0.023BD-1.000×10-3CD-0.36A2-0.16B2-0.075C2-0.22D2。

由表3可知，根據回歸方差分析顯著性檢驗，p＜0.000 1，說明回歸模型方程達到極顯著水平；失擬值p=0.055 1＞0.05，不顯著；回歸模型的決定性系數R2=0.988 8，模型校正系數R2Adj=0.977 6，說明回歸方程與試驗擬合良好，誤差小。由表3中F值可知，A和B對葛根素提取率影響極顯著（p＜0.01），C和D為模型顯著因素（p＜0.05）；交互項AB和BD對葛根素提取率影響顯著（p＜0.01）；二次項A2、B2、C2和D2對葛根素提取率影響極顯著（p＜0.01），其余各項對葛根素得率影響均不明顯。方差分析可知，即各因素對葛根素提取率影響的大小順序為：離子液體濃度＞料液比＞微波功率＞提取時間。因此，可用該模型分析和預測葛根中葛根素的提取工藝。

表2 試驗設計與結果

表3 微波輔助離子液體提取葛根素回歸方程方差分析

2.2.2 數學模型及響應面分析[17]

采用Design Expert 8.0軟件對離子液體濃度（A）、微波功率（B）、料液比（C）和提取時間（D）之間交互作用的關系進行分析。響應曲面和等高線的平緩與陡峭程度能夠直觀體現出反映各因素之間相互作用的強弱，提取參數交互作用對葛根素提取率的響應曲面見圖5～圖10。

由圖5～圖10可知，隨著離子液體濃度、微波功率、料液比和提取時間的增大，葛根素的提取率先升高后降低，影響葛根中的葛根素提取率的各交互作用因素順序為AD＞AB＞BD＞BC＞CD＞AC。

圖5 離子液體濃度和微波功率對葛根素提取率的影響

圖6 離子液體濃度和料液比對葛根素提取率的影響

圖8 微波功率和料液比對葛根素提取率的影響

圖9 微波功率和提取時間對葛根素提取率的影響

圖10 提取時間和料液比對葛根素提取率的影響

2.2.3 驗證試驗

通過Design Expert 8.0對試驗模型進行分析，求解方程得到最佳提取工藝為：離子液體濃度1.02 mol/L，提取時間7.87 min，料液比1︰21.97（g/mL），微波功率度407.92 W，理論預計值4.227%。考慮操作條件，將實際工藝參數調整為離子液體濃度1.0 mol/L，提取時間8 min，料液比1︰22（g/mL），微波功率度400 W，在此條件下葛根素提取率的實際值為4.201%，與軟件模擬值預測誤差為0.61%，實際與模型符合良好，因此，證實了模型的有效性。

3 結論與討論

試驗研究采用微波輔助離子液體提取葛根中的葛根素。在單因素試驗的基礎上，運用響應面法對葛根素提取條件進行優化，建立回歸模型方程，得到最佳提取工藝參數為：離子液體濃度1.0 mol/L，提取時間8 min，料液比1︰22（g/mL），微波功率度400 W。此條件下葛根素的提取率為4.201%，較文獻已報道的提取率有較大提高[18]。與傳統溶劑提取方法相比，離子液體的極性可控，可對樣品高效、充分的萃取，所需溶劑少，離子液體可重復利用，是一種快速高效提取葛根素的理想方法。