反復凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白

張安寧，王曄，李照晴，孫麗慧*

大連理工大學海洋科學與技術學院（盤錦 124221）

米糠是稻谷加工過程中的副產物，通常占稻谷質量的6%～8%，卻含有占稻谷約60%的營養成份及90%的人體所需營養素，有“天然營養寶庫”之稱[1]。米糠中包含11%～16%[2]粗蛋白，米糠蛋白與大豆蛋白接近，其氨基酸組成符合FAO/WHO推薦營養模式[3-4]，蛋白消化率達90%以上且過敏性低，因而在嬰幼兒配方食品中有著廣泛應用[5]。

米糠蛋白的提取方法主要包括強堿法、酶法和物理法[6-7]。酶法提取，可以保持較好的蛋白營養性和功能性，例如王曉雅等[8]利用堿性蛋白酶，在溫度60℃，pH 9.5條件下提取3 h，可獲得米糠的蛋白的提取率為75.42%，但酶的成本較高，后處理繁瑣，該方法還適用于大規模工業化生產；物理方法簡單方便，但提取效率偏低，常被用作米糠蛋白提取的輔助方法，如于雷等[9]利用超聲輔助雙酶法提取米糠蛋白，在功率220 W條件下超聲20 min，用α-淀粉酶和蛋白酶進行酶解，在最優條件下米糠蛋白的提取率可達80.83%；堿提取法簡單經濟，且提取率高，如Chen等[10]在溫度25 ℃，pH 12條件下提取1 h，米糠蛋白提取率為82.50%，然而在強堿條件下蛋白變性程度高，而且還會加速美拉德反應，影響蛋白的營養價值。

反復凍融是一種較溫和的破壁方式，主要通過細胞內冰粒形成和殘余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，如此反復達到破壁的目的。試驗采取反復凍融輔助弱堿法（在pH 9.5條件下）提取米糠蛋白，并對其功能特性進行分析，為米糠蛋白進一步利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠（遼寧恒際生物科技有限公司）；蛋白相對分子質量Marker、牛血清白蛋白（生工生物工程（上海）股份有限公司）；其他化學藥品均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

H1850臺式高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；UV-5800紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；KDN-04C凱氏定氮儀（上海洪紀儀器設備有限公司）；FD-1C-50真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；DYY-8C型電泳儀及DYCZ-24DN電泳槽（北京六一儀器廠）；Zeta sizer Nano ZS-納米粒度與ZETA電位分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白的制備

新鮮米糠通過80目篩子剔除雜質，使用正己烷按料液比1︰10（g/mL）脫脂。脫脂米糠使用弱堿（氫氧化鈉溶液，pH 9.5）按料液比1︰10～1︰25（g/mL）浸泡，并將其放入-20 ℃環境下進行冷凍4 h，于45℃條件下解凍，反復凍融1～6次，每次凍融后都使用0.1 mol/L濃度的NaOH或HCl調節料液pH，使其維持在9.5；處理好的料液于35～50 ℃條件下進行堿提1～3 h（pH 9.5），邊提取邊攪拌，以4 500 r/min離心20 min分別得殘渣和上清液，殘渣水洗1次后離心，合并上清液；上清液調至pH 4.5進行酸沉，以4 500 r/min離心20 min，對蛋白沉淀收集并進行真空冷凍干燥回收得到米糠蛋白。

1.3.2 提取工藝的優化

1.3.2.1 單因素試驗

分別以凍融次數、料液比、提取時間和提取溫度4個因素進行單因素試驗，以米糠蛋白提取率為衡量指標，具體方案如表1。

表1 蛋白提取條件的單因素試驗

1.3.2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗設計選出反復凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白的最優條件。

表2 正交試驗的因素與水平

1.3.3 分析測定方法

1.3.3.1 蛋白含量測定

使用采用凱氏定氮法測定脫脂米糠中粗蛋白含量及所提取的米糠蛋白產品純度，采用考馬斯亮藍法測定提取液中米糠蛋白含量，提取率按式（1）計算。

1.3.3.2 米糠蛋白的性質

1) 持水性和持油性

米糠蛋白用去離子水/大豆油稀釋到10 mg/mL并充分混合，于5 000 r/min的轉速下離心30 min，小心移除上清液。持水/油性（WHC/OHC）按式（2）計算[11]。

2) 起泡性和泡沫穩定性

使用去離子水配制100 mL 1 g/100 mL米糠蛋白溶液，用高速分散均質機在1 000 r/min均質2 min，迅速倒入量筒記錄泡沫體積V1，靜置30 min后，再次測量泡沫體積V2，起泡性（FC）和泡沫穩定性（FS）按式（3）和（4）計算[12]。

3) 乳化性及其穩定性

使用0.05 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液中配制1 g/100 mL米糠蛋白溶液，取75 mL蛋白溶液與25 mL大豆油充分混合，在乳化機10 000 r/min轉速下乳化2 min后立刻從燒杯底部吸取20 μL乳狀液，加入5 mL 0.1% SDS溶液混合。以濃度為0.1% SDS溶液為空白樣品，測定500 nm下的吸光度。待乳化液放置10 min后，從燒杯底部吸取乳狀液（與0 min取樣點位置相同），按上述方法測定吸光度[13]。乳化活性EAI和乳化穩定性ES按式（5）和（6）計算。

式中：T=2.303；N為稀釋倍數，250；c為乳化液未形成前蛋白質溶液的質量濃度，g/mL；Φ為乳化液中油相體積分數，0.25；A0和A10分別為0和10 min時吸光度；t為間隔時間，10 min。

4) 蛋白溶解度

稱取0.1 g米糠蛋白樣品加入到10 mL去離子水中，將pH分別調至2～11，室溫下磁力攪拌1 h，在3 000 r/min轉速下離心20 min，收集上清液，測其蛋白含量，蛋白溶解度按如式（7）計算[14]。

5) 米糠蛋白Zeta電位滴定曲線

使用去離子水配制2 mg/mL米糠蛋白溶液，采用0.5 mol/L NaOH或0.5 mol/L HCl在持續攪拌條件下滴定蛋白溶液，使其從pH 10.0逐漸降低至pH 2.0，測定不同pH下蛋白微粒Zeta電位。比色池采用規格為1 cm的聚苯乙烯池，采用一對0.45 cm2鉑電極，間距為0.4 cm。測定溫度為25 ℃，溫度平衡時間2 min[15]。

6) 米糠蛋白亞基分布及其相對分子質量的測定

米糠蛋白亞基分布及其相對分子質量的測定采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的方法。稱取10 mg米糠蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，沸水浴加熱5 min。分離膠與濃縮膠濃度分別為15%和5%，上樣量10 μL。染色采用0.25%考馬斯亮藍R-250溶液，脫色采用高甲醇的醋酸溶液。

2 結果與分析

2.1 米糠蛋白的制備

圖1所示，對試驗中反復凍融次數、料液比、提取時間和提取溫度進行單因素試驗優化，優化結果為凍融4次、料液比1︰15（g/mL）、提取時間120 min、提取溫度45 ℃。在單因素試驗基礎上，以米糠蛋白提取率為評價指標，利用正交試驗選出反復凍融輔助弱堿法的最佳提取條件，結果如表3。根據極差分析可知影響提取率的主次因素為凍融次數＞提取溫度＞提取時間＞料液比，最佳提取條件為A2B2C3D2，即凍融4次、提取溫度45 ℃、提取時間150 min、料液比1︰15（g/mL）。

在最優條件下使用反復凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白，結果如圖2所示。使用反復凍融輔助弱堿法制備米糠蛋白提取率和純度分別為63.07%和66.61%，與等同條件下只采用弱堿法制備米糠蛋白相比，提取率提高11.49%，而蛋白純度基本沒有明顯改變。

2.2 米糠蛋白的性質測定

2.2.1 持水性和持油性

蛋白產品應用在食品配方中時一般都要求具有高持水性和高持油性，如在蛋糕、香腸等加工食品。如圖3所示，與單獨使用弱堿法提取米糠蛋白相比，凍融輔助弱堿提取蛋白的持水性略有降低，而持油性基本沒有改變。Aletor等[16]認為，蛋白持水性在1.49～4.72 g/g范圍內，可應用于各種黏性食品中。試驗采用凍融輔助弱堿提取的米糠蛋白的持水性為3.58 g/g，表明其仍具有較好持水性。

2.2.2 泡沫特性

蛋白泡沫特性反映其降低水-空氣界面表面張力的能力，這與蛋白分子結構密切相關，且在食品工業中形成泡沫可以增加產品的體積。試驗結果如圖4所示，蛋白樣品的泡沫特性并無區別，表明反復凍融輔助弱堿提取米糠蛋白并未對其發泡能力和泡沫穩定性產生不良影響。

圖1 不同因素對米糠蛋白提取率的影響

表3 正交試驗結果

圖2 提取方式對米糠蛋白提取率和純度影響

圖3 提取方式對米糠蛋白持水/油性的影響（WHC持水性；OHC持油性）

圖4 提取方式對米糠蛋白持水/油性和泡沫特性的影響（FC起泡性；FS泡沫穩定性）

2.2.3 乳化特性

乳液的形成是由于蛋白結構中存在著一些疏水基團和親水基團，蛋白的乳化特性是其在食品工業中用作表面活性劑的一個重要參考，而牛血清白蛋白（BSA）則常被用作比較蛋白乳化性能的參考標準[17]。從圖5可以看出，與單獨使用弱堿提取米糠蛋白相比，凍融輔助弱堿法提取蛋白的乳化性及其穩定性并無明顯差異。與BSA相比，2種方式提取的米糠蛋白樣品均有著較好的乳化穩定性，但乳化性則差于BSA。

圖5 提取方式對米糠蛋白乳化性及其穩定性的影響（EAI乳化性；ES乳化穩定性）

2.2.4 蛋白溶解度及Zeta電位滴定曲線

如圖6所示，2種方式提取的米糠蛋白樣品表現出相同的蛋白溶解曲線，即曲線的形狀類似于“U”形，在pH 4～5（等電點附近）溶解度最低，pH低于4或高于5時，蛋白溶解度緩慢提高，但pH大于10時，溶解度又出現下降趨勢，這可能與高濃度堿性條件下蛋白的變性有關。

Zeta電位是帶電顆粒表面剪切層的電位，是表征蛋白在溶液中的穩定性的重要指標[18]。從圖7中可以看出，2種方式提取的米糠蛋白樣品Zeta電位滴定曲線并無明顯區別。單獨使用弱堿提取的米糠蛋白在pH 4.36時Zeta電勢為0，為其等電點；使用凍融輔助弱堿提取的米糠蛋白在pH 4.31時Zeta電勢為0，為其等電點。蛋白在等電點溶解度最低，試驗結果與圖5中米糠蛋白溶解度的變化一致。

圖6 不同方式提取的米糠蛋白溶解度

圖7 不同方式提取的米糠蛋白Zeta電位滴定曲線

2.2.5 蛋白亞基分布及其相對分子質量

圖8 不同方式提取的米糠蛋白SDS-PAGE圖

SDS-PAGE凝膠電泳常被用來研究蛋白中亞基的分布變化及相對分子質量測定[19]。對米糠蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白亞基分布如圖8所示。可以看出，2種不同提取方式得到的米糠蛋白電泳圖譜并無明顯區別，可見反復凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白對其亞基分布及其相對分子質量基本沒有影響。這2個蛋白樣品的亞基相對分子質量分布主要分為3個區域，即42.7～66.2 kDa；31.0～42.7 kDa和＜31.0 kDa。

3 結論

以米糠為原料，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗對反復凍融輔助弱堿法提取米糠蛋白的工藝進行了優化，得到的最優條件為：反復凍融4次、料液比1︰15（g/mL）、提取溫度45 ℃及提取時間150 min。在此條件下進行驗證試驗，蛋白的提取率為63.07%，純度為66.61%。該方法制備的米糠蛋白的特性良好，其蛋白泡沫特性、持油性、乳化穩定性、溶解度、Zeta電位滴定曲線及蛋白亞基相對分子質量分布與單獨利用弱堿法提取的米糠蛋白樣品對比并無明顯差異，而持水性略有降低。研究表明凍融輔助弱堿提取米糠蛋白能明顯提高提取率，且該方法操作簡單，不需要復雜或昂貴的設備，是一種切實可行的米糠蛋白提取方法。