豆清多肽發酵液不同超濾組分抗氧化及抑菌活性

尹樂斌 *，周娟，何平，李立才，趙良忠

1. 邵陽學院食品與化學工程學院（邵陽 422000）；2. 豆制品加工技術湖南省應用基礎研究基地（邵陽 422000）

豆清液是傳統豆制品生產蹲腦和壓榨過程中產生的廢水[1]，有研究表明每生產1萬 t大豆，可產生9.7萬 t的豆清液。隨著近年來豆制品行業的飛速發展，以及國家、人民環保意識的增強，豆清液直接排放所帶來的環境污染和資源浪費的問題越來越受到關注，豆制品加工廢水資源化利用成了必然的趨勢。研究表明，傳統豆清液綜合利用主要集中在活性成分提取[2-4]、豆清發酵液凝固劑開發[5-7]以及豆清液產品開發[8-10]等，在很大程度上促進了豆清液綜合利用的發展，但是一直處在摸索探究階段。近年來，在貴州地區也出現了利用豆清液發酵制備酸湯的研究，為豆清液綜合利用提供了新的思路，也得到了行業內的認可，具有較大的應用前景[11]。

豆清多肽發酵液是豆清液經過特定的菌種發酵得到的含豆清多肽的豆清液，是在豆清液微生物發酵的研究基礎上，為增加豆清液的附加值而拓展的豆清液綜合利用新途徑。此次試驗通過超濾的方式，將豆清多肽發酵液進行分級，分別測定不同組分的體外抗氧化活性及抑菌活性，并與未發酵的豆清多肽進行比較，以期以最簡單的方式了解不同超濾組分的生理活性功能，為進一步開發豆清多肽類產品提供理論依據和方法參考。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

豆清液（收集于實驗室）；乳酸菌（實驗室分離鑒定）；N, N-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺（國藥集團化學試劑有限責任公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、β-巰基乙醇（北京鼎國生物技術有限責任公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，天津市光復精細化工研究所）；溴酚蘭、考馬斯亮藍R-250：生工生物工程（上海）股份有限公司；TEMED；過硫酸銨（西隴科學股份有限公司）；2,2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）[2,2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基（1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical，DPPH）：上海如吉生物科技發展有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

培養箱；SW-CJ-2FD雙人單面（垂直）凈化工作臺（江蘇通凈凈化設備有限公司）；UV2900紫外-可見分光光度計（上海恒平科學儀器有限公司）；SCIENTZ-18N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；微濾機組（配制10 kDa，5 kDa，3 kDa和800 Da的超濾膜，上海摩速科學器材有限公司）；Czone系列抑菌圈測量及菌落計數儀（杭州迅數科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆清多肽發酵液制備

在已有的研究基礎上，將新鮮豆清液經過高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）后將實驗室已有乳酸菌種：鼠李糖乳桿菌3-1（Lɑctobɑcillus rhɑmnosusstrain 3-1）、玉米乳桿菌5-1（Lɑctobɑcillus zeɑestrain 5-1）、副干酪乳桿菌5-2（Lɑctobɑcillus cɑseistrain 5-2），按1︰1︰1的比例接種到豆清液中，菌種添加量為豆清液體積的4%，在37 ℃下發酵12 h，得到豆清多肽發酵液。

1.3.2 超濾分離

將豆清多肽發酵液和未發酵的豆清液分別離心（4 000 r/min，15 min），然后分別通過纖維膜和10 kDa，5 kDa，3 kDa和800 Da的超濾膜，設置壓力60 MPa，室溫下進行回流超濾。樣液初始體積為1 500 mL，首先通過纖維膜過濾不溶性物質，然后通過10 kDa的超濾膜，當截留液體積剩下200 mL時，收集截留液，將濾過液繼續通過5 kDa的超濾膜，當截留液剩下200 mL時，收集截留液，將濾過液繼續通過3 kDa的超濾膜，依次類推由大到小經過超濾膜。分別收集＞10 kDa，5～10 kDa，3～5 kDa，800 Da～3 kDa和＜800 Da的組分。將收集的不同組分樣品冷凍干燥，于-20 ℃保存備用。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳

采用不連續體系垂直板電泳對發酵和未發酵的豆清多肽相對分子質量分布進行分析，電泳濃縮膠的濃度為5%，分離膠濃度為12%。凝膠厚度為1 mm。在泳道中分別加入10 μL Marker未發酵和發酵豆清多肽凍干粉供試品溶液各30 μL，開始電泳。設置濃縮電泳電壓80 V、分離膠電泳電壓120 V，待溴酚藍染液完全遷移出凝膠后停止電泳。用0.05%的考馬斯亮藍G-250染液染色30 min，用脫色液（水-乙醇-冰乙酸體積比為60︰30︰10）進行脫色，到條帶清晰為止，重復3次。

1.3.4 體外抗氧化活性測定方法

OH自由基清除率測定參考Smirnoff等[12]的方法；ABTS自由基清除率測定參考Re等[13]的方法；DPPH自由基清除率測定參考Moyo等[14]的方法。

1.3.5 抑菌活性測定

抑菌活性的測定采用牛津杯法，通過不同超濾組分抑菌圈大小判斷其對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效果。菌懸液制備：將供試大腸桿菌和金黃色葡萄球菌從固體斜面培養基上接種至平板上，于37 ℃培養24 h，連續轉接兩代。在無菌條件下，取活化好的菌株，用接種環分別挑取1環已活化好的菌種放入9 mL無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液，濃度為107～108CFU/mL，備用[15]。用移液槍吸取100 μL菌懸液于平板中，用涂布棒涂布均勻，無菌操作，在培養基表面垂直放上牛津杯（內短6 mm、外徑8 mm、高10 mm），輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，在杯中加入100 μL豆清多肽的不同超濾組分樣品，勿使其外溢，每個樣品重復3次[18]，在37 ℃培養箱中培養24 h，觀察抑菌圈大小，采用全自動菌落分析儀，測量每個培養皿中抑菌圈的直徑，取平均值。無菌水作為空白對照[16-17]。

1.4 數據處理

試驗數據運用Origin 9.0進行處理分析，運用SPSS軟件進行統計分析，每組試驗平行3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 發酵與未發酵SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳結果

凝膠電泳的結果如圖1所示。對比Marker可知，未發酵豆清多肽在20～31 kDa以及31～45 kDa之間出現條帶，但大部分成彌散狀態，這可能是制備豆腐的過程中大豆的浸泡時間較長，大豆的內源蛋白酶對其蛋白質的分解作用相關[19]，而發酵過后的豆清多肽沒有條帶，說明發酵對蛋白質有降解作用，發酵過后多肽的相對分子質量減小，這與劉麗莎等[20]的研究結果相似。

圖1 發酵與未發酵SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳結果圖

2.2 不同超濾組分體外抗氧化結果

2.2.1 不同超濾組分對DPPH自由基清除效果比較

DPPH是一種穩定的氮中心自由基，由于其具有單電子，其醇溶液在517 nm具有明顯的吸收峰，當DPPH中單電子與其他抗氧化中的單電子配對時，517 nm處吸光度降低，由于這種變化與接受電子數量呈定量關系，所以DPPH常被用作體外抗氧化的分析試劑[21]。從DPPH的清除效果來看，發酵和未發酵的樣品均對DPPH自由基表現出一定的清除活性（圖2和表1）。從不同超濾組分上看，無論是發酵還是未發酵樣品，800 Da～3 kDa組均比其他組分的清除活性要強，在統計學上有顯著差異（p＜0.05），這與周婷婷等[22]的研究結果5 kDa以下相對分子質量的大豆多肽自由基清除能力較強結果一致。對比發酵和未發酵樣品可以發現，經過發酵以后樣品的DPPH清除活性在一定程度上有所提高，這可能與低相對分子質量的多肽含量增加，更多能與自由基結合的活性位點暴露出來有一定的關系。

圖2 不同超濾條件對樣品DPPH清除活性

表1 不同超濾條件發酵與未發酵DPPH清除效果EC50值

2.2.2 不同超濾組分對ABTS自由基清除效果比較

2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，與過二硫酸鉀反應，生成綠色的ABTS自由基，在734 nm處有特征吸收峰，當ABTS溶液與具有抗氧化活性的物質反應時，體系顏色降低，在734 nm處的吸光度降低，由于其反應靈敏、操作簡單，也經常被用作體外抗氧化活性的評定標準[23]。如圖3所示，從不同超濾組分分析，在800 Da～3 kDa相對分子質量范圍內的樣品表現出較強的ABTS自由基清除活性，比同類型其他組分樣品清除活性強，但同一類型（發酵和未發酵）不同超濾組分之間對ABTS清除能力強弱沒有發現規律。比較同一組分發酵和未發酵超濾樣品的清除活性可以得出，經過發酵部分組分的清除效果有所提高（＞10 kDa，3～5 kDa和＜800 Da），但是5～10 kDa和800 Da～3 kDa組分樣品發酵和未發酵的EC50值沒有顯著差異（p＞0.05），見表2。

圖3 不同超濾條件對樣品ABTS清除活性

表2 不同超濾條件發酵與未發酵ABTS清除效果EC50值

2.2.3 不同超濾組分對OH自由基清除效果的比較

OH自由基是生物體內最重要的活性氧自由基之一，是活性氧中對生物體毒性最強，危害最大的一種自由基，與細胞輻射損傷、腫瘤、衰老等密切相關[24-25]。因此，OH自由基的清除效果常被作為體外抗氧化活性的重要考察標準。從表3可以看出，發酵和未發酵組分對OH自由基均表現出較強的清除效果，活性最強的組分當其清除活性達到50%時，樣品的濃度為1.06±0.02 mg/mL。從不同超濾組分來看（圖4），800 Da～3 kDa的組分依然表現出最強的清除活性，與其他組分存在顯著差異（p＜0.05），不同組分之間的清除效果依然沒有規律；但是通過比較，在800 Da～5 kDa之間，表現出相對分子質量越小，清除活性越強的規律，這與郁曉敏等[26]的研究結果抗氧化性和穩定性最好的大豆肽組分的相對分子質量在1 200～1 400 Da之間結果相似。比較發酵與未發酵各組分的OH自由基清除活性可以看出，經過發酵以后，各組分的清除效果均有所提高，提高最大的組分（＞10 kDa）其EC50濃度降低了2.3 mg/mL，可能的原因與發酵使多肽與自由基結合的基團暴露出來有關。

2.3 不同超濾組分抑菌活性分析

2.3.1 不同超濾組分對大腸桿菌的抑制效果分析

豆清液在發酵過程中乳酸菌利用豆清液中的營養物質，一方面水解大分子蛋白質，另一方面產生有機酸，特別是乳酸，使得發酵后不同的豆清液組分具有一定的抑菌效果，另外發酵過程中抑菌素產生也是使發酵液具有抑菌效果的原因[27]。對比發酵和未發酵的抑菌效果可以得出，發酵過后各組分均對大腸桿菌存在一定的抑菌活性，在平板中出現了比較明顯的抑菌圈，但是未發酵的樣品幾乎未出現抑菌圈，在添加3～5 kDa及5～10 kDa未發酵樣品的牛津杯周圍的細菌生長狀況還比其他地方的細菌生長狀況要好，說明未發酵的3～5 kDa及5～10 kDa樣品可能對大腸桿菌的生長狀況有促進作用。比較發酵樣品不同超濾組分的抑菌圈直徑大小（表4）可以得出，＞10 kDa的組分抑菌圈最小，800 Da～3 kDa的組分抑菌圈最大。當超濾膜孔徑大于800 Da時，各組分之間存在隨著膜孔徑減小，各組分對大腸桿菌的抑制活性增強的趨勢，但＜800 Da的組分對大腸桿菌的抑制活性小于800 Da～3 kDa的組分，與3～5 kDa無顯著差異。

圖4 不同超濾條件對樣品OH自由基清除活性

表3 不同超濾條件發酵與未發酵OH自由基清除效果EC50值

表4 不同超濾組分發酵與未發酵樣品對大腸桿菌抑菌圈直徑

2.3.2 不同超濾組分對金黃色葡萄球菌的抑制效果分析

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，其細胞壁主要由肽聚糖和磷壁酸組成，抑菌機制和革蘭氏陰性菌有一定的差異。不同超濾組分對金黃色葡萄球菌的抑制效果和大腸桿菌有一定的區別。雖然不同超濾組分的豆清多肽發酵液對金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果，平板上面出現了較明顯的抑菌圈，但是抑菌圈中間有一部分細菌又有重新生長的趨勢。從抑菌圈直徑大小（表5）分析，800 Da～10 kDa之間各組分沒有顯著差異，＞10 kDa的部分表現出的抑菌活性較其他組分要稍弱一些。這可能與相對分子質量較大的組分將抑菌類物質包裹，無法發揮作用有關。未發酵的樣品對金黃色葡萄球菌未表現出抑制活性。具體原因還需要進一步探討。

表5 不同超濾組分發酵與未發酵樣品對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑

3 結論

1) 通過乳酸菌發酵的方式得到了豆清多肽發酵液，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對發酵后得到的豆清多肽和未發酵豆清液中的多肽物質進行比較分析，結果表明，未發酵的豆清多肽相對分子質量分布在20～45 kDa之間，經過發酵后多肽相對分子質量在20 kDa以下，說明發酵使豆清液中蛋白質發生了降解。

2) 通過超濾技術對豆清多肽發酵液和新鮮豆清液進行了分離處理，得到＞10 kDa，5～10 kDa，3～5 kDa，800 Da～3 kDa和＜800 Da的組分。對發酵和未發酵樣品的DPPH，ABTS，和OH自由基的清除效果進行了比較分析，發現發酵和未發酵的樣品各組分均對這幾種自由基顯示出較強的清除活性，經過發酵以后清除活性在一定程度上有所增強，其中發酵的800 Da～3 kDa組分樣品表現出最強清除活性。

3) 對發酵和未發酵不同超濾組分的抑菌活性進行探究，結果表明，經過發酵的樣品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制效果：對大腸桿菌的抑制效果，800 Da～3 kDa的組分效果最好；對金黃色葡萄球菌的抑制效果，＜10 kDa的組分沒有顯著差異。