板栗殼棕色素對酪蛋白酸鈉的熒光淬滅作用

郭城

武漢設計工程學院食品與生物科技學院（武漢 430205）

在眾多天然色素中，棕色素在食品著色中占有重要地位，應用十分廣泛，但品種并不多[1]。板栗殼是板栗加工過程中的廢棄物，從中可提取得到一種天然棕色素，其主要活性成分為黃酮類化合物[2]。這種色素安全無毒、水溶性好、著色力強、性質穩定，可廣泛用作食品、日用化學品和藥品等產品的著色劑[3-5]。另外，黃酮類的物質具有抗氧化、抗衰老的功效，故板栗殼棕色素不僅具有著色功能，而且有一定藥用價值，發展前景十分廣闊[6]。

酪蛋白是乳蛋白的主要成分（約占80%）[7]，酪蛋白酸鈉是通過堿中和酸性酪蛋白產生的[8]，其干粉完全溶解于水中，具有良好的表面活性、穩定性、成膠性、親水性和自組裝特性，是良好的制備納米載體的材料[9]。

近年來，有將板栗殼棕色素應用于乳制品的研究[10-11]，但對板栗殼棕色素與牛奶中蛋白質相互作用的研究還很少。因此，以酪蛋白酸鈉與板栗殼棕色素復合體系為對象，通過調控質量比研究板栗殼棕色素對酪蛋白酸鈉的熒光淬滅作用，探討兩者相互作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗殼（市售新鮮板栗，洗凈后剝殼，板栗殼于60 ℃烘干，粉碎后過50目篩，去除絨毛，粉末備用）；酪蛋白酸鈉（生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；丙酮（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氯仿（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；正丁醇（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

SP-754PC型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；RF6000型熒光分光光度計（日本島津制造所）；Nexus470型紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；85-2型數顯恒溫磁力攪拌器（上海精風儀器有限公司）；CyberScan pH 510型pH計（Eutech儀器有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 板栗殼棕色素的制備

參照文獻[12]方法略有改動。板栗殼粉在40 ℃、固液質量比1︰15條件下，用0.5 mol/L NaOH水溶液浸提8 h；經尼龍網布過濾，在5 000 r/min條件下離心30 min，收集上清液；將正丁醇-氯仿混合液（1︰4V/V）與上清液混合，去除蛋白；收集水相，并用2 mol/L的HCl調節至pH 2.0，靜置2 h后于5 000 r/min條件下離心30 min，收集沉淀；沉淀用pH 11的NaOH水溶液溶解，重復使用HCl處理上清液，收集沉淀，直至酸無色；沉淀用無水乙醇洗至無色，殘渣進一步用乙酸乙酯洗3次，用丙酮洗3次，冷凍干燥獲得板栗殼棕色素粉末。

1.3.2 板栗殼棕色素紫外-可見光譜測定

將一定量的板栗殼棕色素溶于Tris-鹽酸緩沖液（50 mmol/L，pH 9.0），室溫攪拌2 h，配制成1 mg/mL溶液。使用紫外-可見分光光度計在波長200～800 nm范圍內每間隔1 nm定點測定其吸光度，并繪制紫外-可見光譜圖。

1.3.3 板栗殼棕色素紅外光譜測定

按固液質量比1︰50取板栗殼棕色素樣品粉末與KBr研細均勻，制成透明薄片，利用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行分析，測定波數400～4 000 cm-1，掃描次數32次，分辨率4 cm-1。

1.3.4 酪蛋白酸鈉-板栗殼棕色素混合樣品溶液配制

用Tris-鹽酸緩沖液（50 mmol/L，pH 9.0）配制0.5 mg/mL酪蛋白酸鈉溶液，向其中加入不同質量的板栗殼棕色素，使酪蛋白酸鈉與板栗殼棕色素的質量比達到1︰0，1︰0.1，1︰0.2，1︰0.3，1︰0.5，1︰0.8，1︰1.0和1︰1.5，室溫攪拌2 h，備用。

1.3.5 熒光光譜測定

采用島津RF6000型熒光分光光度計進行熒光光譜掃描，激發波長分別設置成280和295 nm，激發縫寬10 nm，記錄熒光強度的變化。

1.3.6 數據處理

結果應用Origin 8.5軟件進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 板栗殼棕色素紫外-可見光譜分析

由圖1可以看出，板栗殼棕色素具有典型的黑色素類紫外可見光譜圖。最大吸收波長為208 nm，與其他報道的黑色素最大吸收波長210 nm一致[13]。此外，試驗制備的板栗殼棕色素在279 nm處有典型的肩狀峰，文獻[14-15]表明，在270～280 nm區域的肩狀峰，通常出現在天然黑色素光譜中，而在化學合成的黑色素中則不存在，這是由于與天然黑色素結合的蛋白質所致。

圖1 板栗殼棕色素紫外-可見光譜圖

由圖2可知，波長在400～600 nm范圍內，板栗殼棕色素的對數吸光度具有良好線性，并且斜率為-0.002 05。據報道，不同來源的黑色素也具有這種負斜率的特征對數吸光圖[13]。

圖2 板栗殼棕色素對數吸光圖

2.2 板栗殼棕色素紅外光譜分析

由圖3可知，板栗殼棕色素在2 931 cm-1處具有吸收峰，這是由脂肪族C—H結構拉伸振動產生的；在1 721 cm-1處的峰是由COOH結構中C＝O的拉伸振動產生的；1 615 cm-1處的峰是由芳香環中C＝C結構拉伸振動產生的；1 372 cm-1處的峰是由酚羥基變形振動產生的；1 150和1 078 cm-1處的峰是由脂肪族基團的骨架振動產生的。這些主要吸收峰與文獻[12，16]中報道的黑色素相似，說明試驗制備的板栗殼棕色素屬于黑色素類。

圖3 板栗殼棕色素紅外光譜圖

2.3 酪蛋白酸鈉-板栗殼棕色素混合樣品熒光光譜分析

當一些小分子物質加入到蛋白質溶液形成復合物后，熒光強度降低，這種現象稱為熒光淬滅[17]。熒光淬滅法是研究蛋白質與小分子相互作用的重要手段，研究蛋白質的熒光淬滅過程能夠得到蛋白質與小分子相互作用的結合常數、作用區域及位置等信息[18]。

酪蛋白的熒光主要來自于色氨酸和酪氨酸，當淬滅劑無限接近色氨酸和酪氨酸殘基時會發生熒光淬滅[19]。采用不同的激發波長研究復合物中色氨酸和酪氨酸基團，激發波長280 nm時，色氨酸和酪氨酸殘基均能被激發，激發波長295 nm時，僅色氨酸被激發[20]。比較2種激發波長下的熒光淬滅情況，可以判斷色氨酸和酪氨酸的變化。

圖4 酪蛋白酸鈉-板栗殼棕色素復合物發射熒光光譜（激發波長280 nm）

圖5 板栗殼棕色素-酪蛋白酸鈉復合物發射熒光光譜（激發波長295 nm）

圖4 和圖5是激發波長280和295 nm時，不同添加量板栗殼棕色素色素誘導的酪蛋白酸鈉-色素復合物的發射熒光光譜。單一的酪蛋白酸鈉具有較高的熒光強度，激發波長280和295 nm時其最大發射峰分別位于337和334 nm處。隨著色素的加入，酪蛋白酸鈉-色素復合物的熒光強度明顯降低，色素與酪蛋白酸鈉比例超過0.5︰1后，熒光強度幾乎完全消失。這種現象說明板栗殼棕色素對酪蛋白具有強烈的熒光淬滅效應，色素與蛋白之間可能形成非共價復合物。

F和F0分別為不加淬滅劑和加淬滅劑時酪蛋白酸鈉的熒光強度。由圖6可知，色素與酪蛋白酸鈉比例低于0.5︰1時，色素在2種激發波長下對酪蛋白酸鈉造成的熒光淬滅沒有發生重疊，這表明酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸均參與了與色素的作用[7]。色素添加量較大時，熒光淬滅強烈，使2種激發波長下熒光強度都非常低，導致曲線發生重疊。

圖6 不同質量比酪蛋白酸鈉-板栗殼棕色素復合物Stern-Volmer圖

3 結論

試驗采用堿溶酸沉法從新鮮板栗殼中提取板栗殼棕色素，該色素的紫外-可見光譜在208 nm處具有最大吸收峰，并且在波長400～600 nm范圍內的對數吸光度具有良好的線性關系（斜率為-0.002 05），其紅外光譜也與文獻報道中黑色素相似，說明試驗制備的板栗殼棕色素屬于黑色素類。將酪蛋白酸鈉與板栗殼棕色素按不同質量比（1︰0，1︰0.1，1︰0.2，1︰0.3，1︰0.5，1︰0.8，1︰1.0和1︰1.5）混合后發現，隨著色素的增加，酪蛋白酸鈉的熒光強度大幅度降低，具有強烈的熒光淬滅效應，說明板栗殼棕色素與酪蛋白形成復合物，并且酪蛋白中的色氨酸和酪氨酸均參與了與色素間的相互作用。