高效液相色譜法研究枸杞子中枸杞紅素含量

莊晶玲 ，于洋，楊麗麗，張金宏，靳艷*，馮斌*

1. 中國科學院分離分析化學重點實驗室，中國科學院大連化學物理研究所（大連 116023）；2. 大連醫科大學（大連 116044）；3. 百瑞源枸杞股份有限公司（銀川 750200）

枸杞（Lycium chinenseMiller）是茄科植物，枸杞果實枸杞子是中國傳統的藥食同源藥材，《中藥大辭典》記載枸杞子具有滋補肝腎、益精明目的功效[1]。枸杞子含有枸杞多糖[2]、黃酮、多酚[3]、類胡蘿卜素[4]等多種活性物質，具有抗氧化、降血脂、抗衰老、保肝等生物活性[5]。玉米黃素二棕櫚酸酯（Zeaxanthin dipalmitate）是枸杞子中的最主要的類胡蘿卜素，國內枸杞研究及產業界又將玉米黃素二棕櫚酸酯稱為枸杞紅素。枸杞紅素是一種富含氧的類胡蘿卜素，分子結構上含多個不飽和雙鍵，分子式為C72H116O4（CAS號：144-67-2），其化學結構見圖1。枸杞紅素經皂化反應后可脫去二棕櫚酸生成玉米黃素（Zeaxanthin），玉米黃素和葉黃素是人類視網膜上的主要色素。玉米黃素具有強抗氧化性，大量的人體試驗研究結果表明，補充葉黃素和玉米黃素可改善視覺系統處理速度[6]、降低老年黃斑變性風險[7]，因此玉米黃素具有明確的改善視健康的功效。玉米黃素遇光、熱、酸等不穩定，與游離的玉米黃素相比酯化玉米黃素——枸杞紅素則較為穩定，因此枸杞子中的枸杞紅素更易于發揮藥效[8]。

圖1 枸杞紅素的化學結構圖

枸杞子是含有枸杞紅素含量最高的植物之一[9]，枸杞子的益精明目功效與其富含枸杞紅素密切相關。Weller等[9]最早利用高效液相色譜串聯質譜（LC-MS）分析紅辣椒、錦燈籠、枸杞子等植物中枸杞紅素及玉米黃素，其中枸杞子中的枸杞紅素含量最高，為0.082 4%。Peng等[10]用高效液相色譜法測定不同品種的枸杞子中枸杞紅素，其含量在0.03%～0.5%之間。Zhao等[11]將枸杞子中的枸杞紅素皂化為玉米黃素，用高效液相色譜法測定不同品種的枸杞子中玉米黃素，其含量在0.006%～0.15%之間。雖然HPLC被用于枸杞子中枸杞紅素含量的測定，但是現有的研究并沒有系統研究品種、加工方式、產地等因素對枸杞紅素的影響。

寧夏是中國枸杞子地道產區，也是中國枸杞的主要種植基地，寧夏的枸杞產量約占全國枸杞產量的20%，因此寧夏枸杞在中國枸杞產業中占據重要的地位。枸杞紅素含有極強的抗氧化性，使其極易受環境因素影響[12]。枸杞紅素中存在共軛雙鍵，即含有長鏈不飽和雙鍵結構體系，使枸杞紅素極其不穩定[13]，其對溫度等環境因素特別敏感容易異構化或降解。試驗將以寧夏枸杞為對象，系統研究枸杞子品種、產地、等級及加工方式對枸杞子中枸杞紅素含量的影響，并研究枸杞紅素的穩定性，為篩選富含枸杞紅素的枸杞子，以及保存枸杞紅素提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞樣品（百瑞源枸杞股份有限公司）；枸杞紅素標準品（純度95%，法國Extrasynthese，ZES-0309S）；甲醇、二氯甲烷、乙腈（均為色譜純，天津科密歐）；正己烷、乙酸乙酯、乙醇（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

日立5000高效液相色譜系統（含四元色譜泵、雙波長紫外檢測器、柱溫箱和自動進樣器，日本Hitachi公司）；AX120電子天平（日本Shimadzu公司）；Allegra 64R高速離心機（美國Beckman公司）；離心濃縮機（美國Thermo公司）；JYL-D050料理機（九陽股份有限公司）；Scientz-II D超聲細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；Milli-Q超純水一體機（美國Millipore公司）；旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；手套箱式隔離器（美國VAC公司）。

1.3 色譜條件

高效液相色譜法參考文獻[9]并稍作修改。色譜柱：YMC-carotenoid（C30）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μmol/L）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；流動相A為甲醇-乙腈-水（81︰14︰5，V/V），流動相B為二氯甲烷；梯度洗脫條件：0～3 min，84%A；3～23 min，83%～45% A；23～38 min，45%～25%A；38～43 min，25%～25% A；43～45 min，25%～84%A；檢測波長450 nm。

1.4 標準溶液的配制

精密稱取枸杞紅素標準品，用高效液相色譜的流動相A-流動相B（1︰1，V/V）溶液溶解，配制成100 μg/mL標準溶液。

1.5 枸杞紅素提取方法

精確稱取10 g枸杞子，加5倍水于JYL-D050料理機中打碎，于8 000 g離心10 min，取沉淀冷凍干燥得到枸杞子粗渣。取1 g枸杞子粗渣，加入150 mL正己烷-乙醇混合液（2.6︰1，V/V），以200 r/min機械攪拌20 min，即枸杞子提取液，冷凍干燥枸杞子提取液，即為枸杞紅素提取物。樣品用0.22 μmol/L有機相濾膜過濾后用于高效液相色譜分析。

1.6 枸杞紅素提取物穩定性樣品的制備

冷凍干燥枸杞子提取液，即為枸杞紅素提取物，用于枸杞紅素提取物穩定性的研究。將枸杞紅素提取物，分別在空氣環境和氬氣環境保存考察穩定性。空氣環境的樣品分別保存于室溫和4 ℃環境；氬氣保護的樣品在手套箱氬氣環境中將氣體置換為氬氣并密封，分別保存于室溫和4 ℃環境。4組樣品分別于0，3，9，15，60和120 d測定其枸杞紅素殘余率。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法分析枸杞紅素

利用1.3小節的色譜條件分別分析枸杞紅素標準品及特級寧杞7號枸杞子提取液，色譜圖分別見圖2。枸杞紅素標準品在保留時間29.99 min處的峰為枸杞紅素，枸杞子提取液的色譜圖中主要峰為保留時間29.98 min的峰，其保留時間與枸杞標準品基本一致，初步推斷該峰為枸杞紅素。

為進一步確認圖2（B）中枸杞子提取液中的主峰為枸杞紅素，對該峰在波長300～600 nm范圍內掃描，將枸杞子提取液的主峰的紫外吸收譜與枸杞紅素標準品的紫外吸收譜做比對，結果見圖3。可見在波長300～600 nm范圍內，枸杞子提取液中的主成分與枸杞紅素標準品吸光度特征一致，因此可認為枸杞子提取液中保留時間29.98 min的峰為枸杞紅素。

分別配制質量濃度5，10，25，50和100 μg/mL的枸杞紅素標準溶液，進行高效液相色譜分析，利用峰面積與枸杞紅素濃度繪制標準曲線，線性回歸方程為Y=61 887X-80 482，R2=0.999 5，枸杞紅素在5～100 μg/mL內線性關系良好，定量限LOQ=0.6 mg/kg。

2.2 不同品種的枸杞子中枸杞紅素含量

寧杞7號和寧農杞2號是寧夏種植面積較大的2個枸杞品種，利用高效液相色譜法測定同產于寧夏中寧的寧杞7號和寧農杞2號的枸杞子中的枸杞紅素含量，結果見表1。結果顯示，在產地、等級和干燥方式相同的情況下，寧杞7號的枸杞紅素含量幾乎是寧農杞2號的枸杞紅素含量的兩倍，為2.74±0.11 mg/g。

圖2 枸杞紅素標準溶液的色譜圖（A）與枸杞子提取液的色譜圖（B）

圖3 枸杞紅素標準品與枸杞子提取液的紫外吸收譜圖

表1 不同品種枸杞子中枸杞紅素含量（n=3）

2.3 產地對枸杞子中枸杞含量的影響

近年來枸杞種植的產業不斷擴大，枸杞的種植地從寧夏中寧擴大到寧夏其他地區乃至其他省份。比較產于寧夏中寧、賀蘭山、紅寺堡及青海省的寧杞7號枸杞子中的枸杞紅素含量，結果見表2。在其他條件相同的情況下，產于寧夏中寧的枸杞子中枸杞紅素含量顯著高于其他3個產地，寧夏紅寺堡和青海產地的枸杞子的枸杞紅素含量相當。從枸杞紅素含量的角度來看，寧夏中寧地區作為枸杞的主產地具有天然的優勢。

表2 不同產地的枸杞子中枸杞紅素含量（n=3）

2.4 等級對枸杞子中枸杞紅素含量的影響

以寧杞7號為對象，研究不同等級的枸杞子中枸杞紅素的含量。枸杞子等級是百瑞源枸杞股份有限公司按照GB/T 18672—2014進行分級提供，結果見表3。在產地、干燥方式相同的情況下，特級枸杞子中枸杞紅素含量最高為2.74±0.11 mg/g，隨著等級下降枸杞紅素含量逐漸降低，乙級的枸杞中枸杞紅素僅1.64±0.09 mg/g。

表3 不同等級的枸杞子中枸杞紅素含量（n=3）

2.5 干燥方式對枸杞子中枸杞紅素含量的影響

新鮮枸杞不易保存，干燥加工是枸杞子最關鍵的加工步驟。傳統的自然曬干方式仍被廣泛使用，近年來隨著技術發展，熱風干燥、真空干燥等技術也被逐漸應用于枸杞子加工中[11]。以寧夏中寧產甲級的寧杞7號枸杞子為對象，研究熱風干燥、真空干燥和自然曬干等幾種干燥方式對枸杞子中枸杞紅素的影響，結果見表4。結果可見，熱風干燥枸杞子中枸杞紅素含量最高，為2.59±0.051 mg/g；自然曬干的枸杞子中的枸杞含量最低，為1.97±0.040 mg/g。

表4 不同干燥方式對枸杞子中枸杞紅素含量的影響（n=3）

2.6 枸杞紅素提取物穩定性

按照1.6小節制備枸杞紅素提取物，制備成保存于隔絕空氣的氬氣密封袋和暴露于空氣的樣品，2種樣品分別保存于4 ℃冰箱和室溫，利用HPLC檢測保存過程中枸杞紅素的殘留率。圖4和圖5分別為未經保護的空氣和氬氣保護環境下枸杞紅素的殘余率變化規律。由圖4可見，在室溫環境下，暴露于空氣120 d的枸杞紅素殘余率約為71.19%，而保存于4 ℃環境下的枸杞紅素樣品殘余率為85.48%，說明低溫可顯著改善長期保存的枸杞紅素的穩定性，特別是對于暴露于空氣中的樣品，這種改善尤其明顯。

由圖5可知，氬氣保護下穩定性好于空氣中樣品，經過120 d后枸杞紅素均在83%以上，說明如果隔絕空氣氬氣保存也可改善枸杞紅素的穩定性。枸杞紅素提取物中枸杞紅素在前15 d枸杞紅素的穩定性變化較大，15 d后逐漸趨于穩定。枸杞紅素提取物最佳的保存條件是隔絕空氣低溫保存，以這種方式放置120 d后的枸杞紅素殘余率約87.41%，因此這種方式可作為枸杞紅素提取物的一種保存方式。

圖4 空氣環境下枸杞紅素的殘余率

圖5 氬氣環境下枸杞紅素的殘余率

3 結論與討論

建立高效液相色譜法分析枸杞子中枸杞紅素的方法，研究枸杞子品種、產地、等級、干燥方式等因素對枸杞紅素含量的影響。

比較了寧夏中寧產的寧杞7號和寧農杞2號2個品種枸杞子中的枸杞紅素含量，寧杞7號的枸杞子的枸杞紅素含量明顯高于寧農杞2號枸杞子，為2.74±0.11 mg/g。比較產于寧夏中寧、賀蘭山、紅寺堡及青海省的寧杞7號枸杞子中的枸杞紅素量，結果顯示寧夏中寧的枸杞子中枸杞紅素含量最高，雖然枸杞紅素并不是道地藥材的評價標準，但枸杞紅素含量的結果說明寧夏中寧的氣候及地理位置非常有利于枸杞子中枸杞紅素的積累。比較特級、甲級、乙級寧杞7號枸杞子的枸杞紅素含量，結果顯示枸杞紅素含量與枸杞子等級密切相關，特級枸杞子中枸杞紅素含量最高，隨著等級下降枸杞紅素含量逐漸降低。比較經過熱風干燥、真空干燥、自然曬干處理的寧杞7號枸杞子中的枸杞紅素含量，熱風干燥枸杞子中枸杞紅素含量最高，自然曬干的枸杞子中枸杞紅素含量最低，兩者相差近1倍，說明傳統的曬干模式并不利于枸杞紅素的穩定。由于枸杞紅素對光、熱、氧氣等因素敏感，自然曬干時光照、溫度、時間等條件不可控，導致部分枸杞紅素降解，因此現代溫度時間可控的干燥方式更有益枸杞子中枸杞紅素的保存。

枸杞紅素作為枸杞中主要的類胡蘿卜素，擁有良好的抗氧化性，主要原因是其含有較長的共軛雙鍵和豐富的活性基團[12]，從而發揮良好的清除自由基的能力，但同時對于環境變化的不穩定性也顯著增加。溫度是一個影響枸杞紅素穩定性的重要因素，隨著溫度增加枸杞紅素的降解也隨之增加，并且放置時間越久，氧化時間越久，也會使枸杞紅素的穩定性下降，因此在儲存枸杞紅素凍干粉的時候，應盡量避光、低溫、隔絕空氣。于4 ℃、隔絕空氣的情況下保存120 d，枸杞紅素殘余率為87.41%，這種方式可作為枸杞紅素提取物的一種保存方式。

越來越多的證據顯示枸杞紅素在眼健康、護肝[13]等方面的藥用價值，然而天然植物中枸杞紅素的含量是制約枸杞紅素制備產業化的關鍵因素。即使是枸杞紅素含量最高的植物——枸杞子，其枸杞紅素含量僅0.27%，因此從枸杞子中制備枸杞紅素顯然不具備商業可行性。但是枸杞多糖、多酚等功能因子的活性已被證實并具備產業化條件，將枸杞紅素的制備與枸杞多糖、多酚等物質相結合，實現枸杞子的綜合利用，不僅實現枸杞子高值化利用，而且可提供功效明確的功能食品。