抑制SGLT對軟脂酸誘導的內皮細胞損傷影響研究

李春盈 蘇悅 陳霞 何航輝 鄭超

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，可出現系統性炎癥反應和氧化應激損傷，導致大血管和微血管病變[1-2]。糖尿病患者發生血管病變時血管內皮結構和功能嚴重受損，而這種改變又是多種心血管疾病的始動因素和中心環節[3-4]。鈉葡萄糖共轉運體（sodium/glucose cotransporter，SGLT）抑制劑上市后，臨床發現其在減弱心血管疾病危險因素和降低全因死亡率上都有明顯的優勢[5]，但相關的基礎研究較少，作用機制不明。SGLT2是轉運葡萄糖的主要載體，存在于腎小管上皮細胞，位于近端S小管的1片段，對葡萄糖的重吸收作用占90%；而SGLT1出現在近曲小管更遠端的S3段[6]，近來發現SGLT1在心臟組織也呈現高表達狀態[7]。臨床研究表明SGLT抑制劑能夠明顯提高機體對胰島素的敏感性，降低血壓、體重和尿酸，對心血管系統起保護作用[8]。而胰島素對血管內皮細胞發揮生物學效應是通過與胰島素受體結合產生的，胰島素與其受體結合后相繼激活胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）、蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT），進而提高下游的內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，促使內源性一氧化氮（NO）輸出，最終起到舒張血管、擴大血流量的作用。可見擴大機體內NO的產量對糖尿病引發的由微循環開放減少引起的心血管并發癥有重要的意義。PI3K/AKT/eNOS信號通路可體內調控NO產量。恢復PI3K/AKT/eNOS信號通路級聯效或可改善內皮細胞損傷。為明確SGLT抑制劑對血管內皮細胞的作用，本研究通過軟脂酸（palmitic acid，PA）建立人臍靜脈內皮細胞的胰島素抵抗模型，分析SGLT表達水平的改變，并探討抑制SGLT對PI3K/AKT/eNOS通路的影響，及對胰島素抵抗下內皮細胞損傷的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞由中國科學院細胞庫提供；PA、不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和 SGLT 抑制劑根皮苷（phloridzin，PH）購自美國Sigma公司；兔SGTT1、兔SGLT2、兔磷酸化eNOS（p-eNOS）、eNOS抗體、兔GAPDH抗體、兔胰島素底物受體 1（IRS-1）、兔磷酸化 IRS-1（p-IRS-1）購于美國Cell Signaling公司；兔磷酸化 AKT（p-AKT）、AKT 抗體購自美國Bioworld Technology公司；NO試劑盒購自美國Cayman公司；ECL化學發光試劑盒、預染蛋白Marker、PCR擴增試劑盒購自美國Thermo公司；PI3K抑制劑LY294002購于美國Sigma公司；SGLT、GAPDH引物購于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及干預 將人臍靜脈內皮細胞分為空白對照組（DMSO組）、PA組、PA+Insulin組、PA+PH組、PA+PH+LY組。DMSO組細胞加入DMSO處理，作對照用；PA組用0.3 mmol/L PA干預18 h建立胰島素抵抗模型；PA+Insulin組、PA+PH組在PA組處理的基礎上再分別給予100 nmol/L胰島素、PH干預30 min；PA+PH+LY組預先加入100 nmol/L LY294009孵育30 min，后再加入PH干預30 min。

1.2.2 各組細胞 SGLT1、SGLT2、p-IRS-1、p-AKT、peNOS蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。各組細胞培養完成后加入細胞裂解液刮取蛋白液，離心取上清液，使用考馬斯亮藍測定蛋白濃度。通過凝膠電泳分離蛋白后電轉至膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，緩沖液洗去脫脂奶粉（5 min×3次），兔 SGTT1、兔SGLT2、兔eNOS、兔 p-eNOS、兔 AKT、兔 p-AKT、兔 IRS-1、兔 p-IRS-1及兔GAPDH抗體4℃孵育過夜，洗膜（5 min×3次），IgGⅡ抗（1:5 000）室溫孵育1 h，最后再洗膜3次，用ECL化學發光法成像，Quantity One軟件分析蛋白表達水平。

1.2.3 各組細胞 SGLT1、SGLT2 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。細胞干預完成后用苯酚-氯仿一步法提取總RNA，用核酸蛋白分析儀測濃度及純度后，按說明書操作合成互補DNA，通過熒光定量PCR分析系統進行檢測，以GAPDH為內參照，測定細胞內目的基因的相對含量。引物序列和退火溫度見表1。

1.2.4 各組細胞NO濃度檢測 采用硝酸鹽還原酶法。收集各組細胞的上清液，依次加入硝酸鹽還原酶、酶反應因子室溫孵育30 min，繼續加入2,3-二氨基萘（DAN）試劑孵育10 min，最后加入氫氧化鈉溶液，使用多功能酶標儀依次測量各孔的熒光值，最后根據標準曲線算出相應樣品的NO濃度。

1.2.5 各組細胞葡萄糖消耗量檢測 采用葡萄糖測定試劑盒檢測。收集各組細胞的上清液，根據試劑盒中提示的步驟，采用葡萄糖還原酶法檢測各組細胞葡萄糖的消耗情況。

1.2.6 siRNA的轉染和實驗分組 當人臍靜脈內皮細胞生長到約60%～70%的融合面積時進行siRNA轉染以沉默SGLT1和SGLT2，分為DMSO組、PA組和PA+si-Ctrl組、PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組，其中 PA+si-Ctrl組細胞用無意義片段轉染。最后采用Western blot法檢測 p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS 蛋白表達水平，方法同1.2.2。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DMSO組、PA組、PA+PH組細胞 SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表達水平比較 DMSO組細胞表達少量的SGLT1、SGLT2蛋白和 mRNA，PA 組細胞 SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表達水平較DMSO組增加（均P＜0.05），PA+PH組細胞SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表達水平較PA組降低（均P＜0.05），見圖1。

圖1 DMSO組、PA組、PA+PH組細胞鈉葡萄糖其轉運體1（SGLT1）、SGLT2蛋白和mRNA表達水平比較（a：蛋白表達電泳圖；b、c：蛋白表達水平比較；d、e：mRNA 表達水平比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 DMSO組、PA組、PA+Insulin組、PA+PH組細胞葡萄糖消耗量與NO濃度比較 PA組細胞葡萄糖消耗量與NO濃度均低于DMSO組（均 P＜0.05），PA+Insulin組、PA+PH組細胞葡萄糖消耗量與NO濃度均高于PA組（均 P＜0.05），見圖 2。

圖2 DMSO組、PA組、PA+Insulin組、PA+PH組細胞葡萄糖消耗量與NO濃度比較（a：葡萄糖消耗量比較；b：NO濃度比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 DMSO組、PA組、PA+PH組、PA+PH+LY組細胞p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表達水平及NO濃度比較 PA組細胞p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表達水平及NO濃度均低于DMSO組（均P＜0.05）。PA+PH組細胞p-AKT、p-eNOS蛋白表達水平及NO濃度均較PA組升高（均P＜0.05），但p-IRS-1蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。PA+PH+LY組細胞p-AKT、p-eNOS蛋白表達水平均較PA+PH組降低（均P＜0.05），但p-IRS-1蛋白表達水平及NO濃度比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖3。

2.4 DMSO 組、PA 組、PA+si-Ctrl組、PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組細胞 p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表達水平比較 PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組細胞p-AKT、p-eNOS蛋白表達水平均明顯高于PA組和PA+si-Ctrl組（均P＜0.05）。與 DMSO 組相比，p-IRS-1在 PA組、PA+si-Ctrl組和 PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組明顯下調，但組間比較均無統計學差異（均P＞0.05），見圖 4。

3 討論

圖3 DMSO組、PA組、PA+PH組、PA+PH+LY組細胞磷酸化胰島素底物受體1（p-IRS-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、內皮型—氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白表達水平及NO濃度比較（a：p-AKT蛋白表達電泳圖和水平比較；b：p-eNOS蛋白表達電泳圖和水平比較；c：p-IRS-1蛋白表達電泳圖和水平比較；d：NO濃度比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 DMSO組、PA組、PA+si-Ctrl組、PA+si-SGLT1組、PA+si-SGLT2組細胞磷酸化胰島素底物受體1（p-IRS-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、內皮型—氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白表達水平比較（a、b、c：蛋白表達電泳圖；d、e、f：蛋白表達水平比較；*P＜0.05，**P＜0.01）

SGLT1、SGLT2是葡萄糖鈉的共轉運體，介導著細胞內外葡萄糖的轉運[9]。SGLT抑制劑主要作用是通過抑制腎小管上皮細胞上葡萄糖的轉運，增加尿糖的排泄，從而降低血糖值[10]。多項臨床及動物研究顯示其不僅可以顯著降低心血管危險因素，改善糖尿病的心血管并發癥[11-12]，并且能夠改善肥胖大鼠的糖脂代謝異常，抑制炎癥反應[13]。另有報道SGLT抑制劑在1型糖尿病小鼠中可以提高AKT、eNOS磷酸化水平，改善內皮功能[14]。SGLT在人體內廣泛存在，有研究證明內皮細胞上存在SGLT[15]。因此深入研究其在內皮細胞上的作用靶點和具體機制是進一步所要解決的問題。

PA作為一種游離脂肪酸，可以很好地模擬2型糖尿病患者血管內皮細胞中高游離脂肪酸的環境[16-17]，其在體內干預胰島素受體底物與胰島素的結合，干擾信號傳導，介導著胰島素抵抗[18]，另一方面PA抑制了AKT/eNOS信號通路的傳遞，而eNOS是體內重要的蛋白激酶，介導著細胞的增殖，遷移和代謝反應[19]，p-eNOS介導了內皮源性的NO生成，NO作為最強的舒血管因子，對維持血管穩態起著關鍵作用[20]。研究結果表明PA可以提升內皮細胞SGLT1、SGLT2含量增加，并且在PA環境下AKT、eNOS磷酸化水平的降低直接導致了內皮源性的NO輸出減少，這與前人的研究結論相符[21]。本研究發現PH可逆轉PA誘導的細胞功能障礙，隨著p-AKT、p-eNOS水平的上調，NO產量增加。通過PI3K抑制劑也進一步證實了是通過AKT上游分子PI3K，使p-AKT、p-eNOS和NO水平上調。因此認為PH可能通過抑制SGLT的功能和異常表達，激活PI3K/AKT/eNOS信號通路傳遞。此外本研究發現PH對PA誘導的p-IRS-1的下調沒有緩解作用，可能其并不通過IRS-1發揮功能。正常情況下，IRS是胰島素信號轉導通路中重要的信號蛋白，IRS-1激活下游的PI3K/AKT，調控著細胞的生長、增殖等作用[22]，然而IRS有很多亞型，因此還需要進一步實驗檢測PA可能存在的作用位點。最后本研究通過選擇性沉默細胞的SGLT1、SGLT2基因，發現在PA環境下AKT/eNOS的磷酸化水平并沒有下降，進一步驗證了在PA誘導下SGLT1、SGLT2與AKT/eNOS信號通路的關系，發現了其保護內皮細胞的潛在作用機制。

綜上所述，降低SGLT1、SGLT2表達，激活 PI3K/AKT/eNOS通路，增加NO的輸出可能是SGLT抑制劑保護血管內皮的作用機制。本研究使用PH培養細胞的時間較短，長時間的應用效果應該會更加明顯。PA誘導內皮細胞損傷和SGLT1、SGLT2表達異常，使細胞代謝障礙，模擬了2型糖尿病患者體內高游離脂肪酸和代謝異常的情況。本研究發現SGLT抑制劑在降糖的同時改善了高游離脂肪酸造成的內皮細胞損傷，有延緩心血管并發癥發生、發展的可能性。盡管PA較好地模擬了內皮細胞胰島素抵抗的模型，為今后探討抑制SGLT對內皮細胞的進一步深入研究打下了基礎，但是該模型仍然無法完全模擬在體內皮細胞胰島素抵抗的狀態。并且PA在人臍靜脈內皮細胞上的具體靶點還需要進一步驗證，以及在體實驗的完善。抑制SGLT為改善胰島素抵抗、降低糖尿病心血管并發癥的發生提供了新的選擇和希望。