脂聯素對結腸癌細胞的抑制作用及機制探索

李鑫 張倩云 徐潔 楊邵瑜 潘月龍

脂聯素（adiponectin,ADPN）是一種脂肪組織分泌的脂肪因子，具有調節能量穩態、調控胰島素敏感性和抗炎等多種有益的生物學功能[1]。ADPN主要通過ADPN受體1和ADPN受體2兩種受體發揮作用，這兩種受體廣泛表達于各種組織器官中[2]。在患有代謝性疾病如肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征的患者中，ADPN水平顯著降低[3]。此外，低ADPN血癥是代謝綜合征的相關癌癥危險因素，如乳腺癌、子宮內膜癌和前列腺癌等[4-6]。

結直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一[7]，研究提示肥胖與結直腸癌相關[8]，營養相關因素可能在結直腸癌的發生、發展中起重要作用[9]。糖尿病和高胰島素、C肽血癥與結直腸癌的高風險相關[10]。有研究指出ADPN在直接抑制腫瘤細胞增殖、腫瘤新生血管形成以及改善外周胰島素抵抗方面具有積極的抗腫瘤作用[11]。此外還有研究發現ADPN水平與癌癥發生風險呈負相關，而體外研究表明ADPN在調控細胞增殖方面起重要作用，雖然具體機制目前尚不明確[4，12]。因此本研究在上述研究的基礎上進一步探討重組ADPN在高糖高胰島素環境下對小鼠結腸癌細胞株MCA38增殖和遷移的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠結直腸癌細胞株MCA38由浙江大學腫瘤研究所惠贈。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠重組ADPN購自北京康肽生物科技有限公司；噻唑藍（MTT）試劑購自中國碧云天公司；RPMI1640培養基、FBS均購自美國Gibco公司；SpectraMaxM3型全波長多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 小鼠結直腸癌細胞株MCA38置于含10%FBS的RPMI1640培養基中，37℃、5%CO2細胞培養箱內培養。當細胞生長覆蓋培養瓶底部面積80%時，以0.25%胰蛋白酶消化，待鏡下觀察收縮至圓形且脫落時，加入培養液終止消化，1 000 r/min離心5 min后，按適當比例（1:3）進行傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 細胞分組 根據處理藥物濃度的不同，將實驗細胞分為6組：空白組、對照組（25 mmol/L葡萄糖+125 μIU/ml胰島素）、A組（25 mmol/L葡萄糖+125 μIU/ml胰島素+2.5 μg/ml ADPN）、B 組（25 mmol/L 葡萄糖+125 μIU/ml胰島素+5μg/mlADPN）、C組（25mmol/L葡萄糖+125μIU/ml胰島素+10 μg/ml ADPN）、D 組（25 mmol/L葡萄糖+125 μIU/ml胰島素+20 μg/ml ADPN）。

1.3.3 細胞增殖抑制率檢測 采用MTT實驗。取對數生長期MCA38細胞接種于96孔板，每孔4×103個細胞，培養24 h貼壁后，分別按上述分組給予不同濃度藥物處理，每個濃度設置4個復孔，作用72 h后，每孔加入 10 μl MTT，繼續培養 4 h，棄去上清液，加入 100 μl二甲基亞砜，震蕩使結晶充分溶解，酶標儀測495 nm處的吸光度（OD值），計算細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%（空白組除外）。

1.3.4 細胞遷移數檢測 采用Transwell實驗。將Transwell小室置于24孔板中，取對數生長期MCA38細胞制備成10×104/L無血清培養液的細胞懸液，上室中加細胞懸液200 μl，分別按上述分組給予不同濃度藥物處理，下室中加入600 μl 20%FBS細胞培養基，37℃孵育24 h，甲醇固定后，結晶紫避光染色30 min，流水清洗，取4個視野，攝像并計數平均細胞遷移數。

1.3.5 細胞增殖與遷移相關蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取上述各組對數生長期細胞，提取蛋白，蛋白定量后上樣，80 V電泳0.5 h后轉120 V凝膠電泳，轉膜，5%牛奶4℃封閉1 h，加入一抗4℃搖床孵育過夜，清洗后加入二抗，4℃搖床孵育2 h，條帶加顯影液后曝光，化學發光成像系統采集圖片，ImageJ軟件分析灰度值，計算胰島素樣生長因子2受體（IGF-2R）、大鼠肉瘤病毒癌基因蛋白（Ras）、過氧化物酶增殖激活受體 γ（PPARγ）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（PAK-1）表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組細胞增殖抑制率比較 對照組、A、B、C、D組任意兩組細胞增殖抑制率比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），且ADPN濃度越高，細胞增殖抑制率越高，見表1。

表1 5組細胞增殖抑制率比較（%）

2.2 6組細胞遷移數比較 空白組、對照組、A、B、C、D組任意兩組細胞遷移數比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），且ADPN濃度越高，細胞遷移數越少。見圖1（插頁）、表2。

圖1 6 組細胞遷移數比較（a：空白組；b：對照組；c：A 組；d：B 組；e：C 組；f：D 組；結晶紫染色，×200）

表2 6組細胞遷移數比較（個）

2.3 6 組細胞 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1 表達水平比較 與對照組比較，B、C、D 組 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1表達水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與A 組比較，C、D 組 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1 表達水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與B組比較，C、D組IGF-2R、Ras表達水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與C組比較，D組IGF-2R、PAK-1表達水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1蛋白電泳圖（IGF-2R 為胰島素樣生長因子2受體；Ras為大鼠肉瘤病毒癌基因蛋白；PPARγ為過氧化物酶增殖激活受體γ；PAK-1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1；a：空白組；b：對照組；c：A 組；d：B 組；e：C 組；f：D 組）

3 討論

結直腸癌是全世界最常見的癌癥之一[7]，肥胖與結腸腺瘤、結腸癌的發病率呈正相關[13]，而結直腸癌合并糖尿病患者的病死率高于單純腸癌患者[14]。慢性高胰島素血癥可能會刺激胰島素受體（IR）信號途徑，從而誘導乳腺癌和胰腺癌的腫瘤生長[15]，還有研究表明隨著胰島素水平增高會增加患結腸癌的風險[16]。Lu等[17]發現胰島素可以通過IR信號、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3（PI3K/AKT/GSK3β）通路以及基質金屬蛋白酶-2的調節來促進結直腸癌HCT116細胞和誘導轉移。

表3 6組細胞 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1表達水平比較

有薈萃分析提示大腸癌和腺瘤患者的ADPN水平明顯低于對照組[18]；同時有學者對17項相關研究作了薈萃分析，發現ADPN水平與結直腸癌的風險之間存在顯著的負相關[7]。ADPN是一種重要的脂肪因子，最初發現其具有為胰島素增敏和調控代謝功能[19]，后來發現在炎癥和細胞增殖等多種細胞周期中其均有所作用[4-6]。目前研究發現ADPN可通過多種途徑發揮其抑癌作用，其中單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）的激活起著核心作用。ADPN激活AMPK并抑制PI3K/AKT、哺乳動物雷帕霉素靶標（MTOR）、絲裂原活化激酶（MAPK）、Wnt-GSK3β以及 Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子（JAK/STAT）通路，從而抑制腫瘤的生長[20-21]。

雖然已經有了一些相關的基礎研究，但ADPN對結直腸癌細胞的作用仍然存在爭議。Ogunwobi等[22]報道了全長和球形ADPN對HT-29結腸癌細胞增殖和細胞因子分泌的促進作用，認為ADPN對結腸癌細胞具有促增殖和促炎作用。2009年，Sugiyama等[23]揭示了ADPN受體在三種大腸癌細胞系HT29、LoVo和HCT116上的表達，還發現ADPN可通過激活AMPK下調mTOR通路，從而抑制腸癌細胞的生長。Kim等[24]研究顯示ADPN在細胞周期的G1/S期抑制結腸癌細胞的增殖。Fenton等[25]報道ADPN處理MC-38小鼠結腸癌細胞不抑制胰島素誘導的細胞增殖，但可通過降低STAT-3的磷酸化和活化來抑制IL-6誘導的細胞增殖。Habeeb等[26]發現ADPN在含糖培養基中抑制結腸癌細胞株的生長，而在無糖培養基中ADPN支持細胞存活，并增加ADPN受體的表達。此外，他們還發現ADPN通過增強自噬機制來支持細胞在缺糖狀態下的存活。還有研究發現ADPN不參與腸癌細胞EMT轉化，而是促進炎癥性IL-6和IL-8細胞因子mRNA的水平增加，研究者認為ADPN可能會通過誘導結直腸細胞中的氧化應激和調節細胞因子的表達，負向調節細胞的存活和遷移。

筆者研究了重組ADPN在高糖高胰島素環境下對小鼠結腸癌細胞株MCA38的抑制作用，發現在高糖高胰島素條件下，ADPN可以顯著抑制MCA38細胞的增殖，且濃度越高抑制作用越顯著。筆者進一步分析加入ADPN后對胰島素促增殖相關的IR信號、下游RASRaf-MAPK通路、細胞周期調節和遷移中關鍵蛋白的表達。IGF-2R屬于I型跨膜糖蛋白，具有多種功能，其既參與IGF-2降解，又參與新合成的甘露糖-6-磷酸基化的溶酶體酶和活化生長抑制物TGFB1等，從而促進凋亡，抑制細胞生長，發揮抑癌作用[27]。在高糖高胰島素條件下，加入ADPN后IGF-2R蛋白表達受到抑制，表明ADPN可通過IGF-2R發揮抑癌作用，它的作用機制可能在下游胞內信號通路傳遞，所以筆者進一步分析了下游RAS-Raf-MAPK通路中關鍵的Ras蛋白表達。Ras蛋白為膜結合型的GTP/GDP結合蛋白，它們是H-ras、K-ras、N-ras的編輯產物，Ras蛋白的活性狀態對細胞的生長、分化、細胞骨架、蛋白質運輸和分泌等都具有影響。抑制Ras蛋白活性能抑制依賴Ras蛋白的腫瘤細胞增殖，也能干擾血管生成[28]。在高糖高胰島素條件下，加入ADPN后Ras蛋白表達受到抑制，可能通過影響RASRaf-MAPK通路抑制腫瘤生長。

此外筆者發現在高糖高胰島素條件下，ADPN可以顯著抑制MCA38細胞的遷移，筆者分析了與細胞遷徙顯著相關的PAK-1和PPARγ蛋白。PAK-1激酶參與整合素和受體類型激酶下游的細胞內信號通路，在細胞骨架動態、細胞黏附、遷移、增殖中發揮重要作用[29]。腫瘤發生上皮-間質轉化（EMT）后細胞表現為極性的喪失、黏附性降低、遷移能力增強，PPARγ是EMT的重要調節因子。研究提示PPARγ激活后，能通過調節E-鈣黏蛋白、Smad復合體和腫瘤微環境等影響腫瘤EMT的發生和發展[30]。本研究發現高糖高胰島素條件下，加入ADPN可以抑制PAK-1和PPARγ的表達。

綜上所述，筆者發現在高糖高胰島素環境中，ADPN作用于小鼠結腸癌細胞株MCA38，可能通過抑制RASRaf-MAPK信號通路和PAK-1和PPARγ遷移相關蛋白來抑制細胞增殖和遷移。雖然ADPN在癌癥中作為分子介質的作用尚未完全確定，但本研究提示ADPN在胰島素通路和結腸腫瘤遷徙中發揮了關鍵的作用，但仍需要進一步的研究來闡明ADPN與結直腸癌相關的潛在分子機制。