關帝山林區不同退化程度草地群落類型土壤細菌群落組成及生物多樣性研究

韓曉麗，黃春國，張蕓香，郭晉平*

（山西農業大學 a.林學院；b.農學院，太谷 030801）

關帝山林區位于山西省境內的呂梁山脈中段，屬于典型暖溫帶大陸性季風氣候區［1］，區域內植物種質資源多樣，森林覆蓋率極高。其中，華北落葉松（Larix principis-rapprechtii）和云杉（Picea asperata）等天然次生林集中分布，而以山蒿（Artemisia brachyloba）、中亞苔草（Carex stenophylloides）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、車前草（Plantago asiatica）、東方草莓（Fragaria orientalis）及禾草科（Gramineae）等為主要優勢植物種的草地植被群落類型也星羅棋布［2-3］，其在保持土壤、調節氣候、涵養水源及保護生物多樣性等方面均發揮關鍵作用［4-5］。由于受氣候變化、環境因子及人畜干擾等因素影響，該區域內草地植被群落存在不同程度的退化現象，導致其質量衰退、群落多樣性降低、生物生產力下降和水土流失的發生，直接或間接影響植被群落生態系統多樣性和生態環境服務功能，給當地生態系統平衡和經濟可持續發展造成了嚴重威脅［6-7］。

地上植物群落、土壤微生物群落及二者間耦合互作均對山地草地生態系統服務功能產生重要影響［8］，且土壤微生物是草地生態系統物質循環和能量轉移的主要參與者［9］，常作為評價草地生態系統土壤質量狀況、草地發育與演替的重要生物學指標［10］。與真菌、放線菌和土壤原生動物等土壤微生物相比，土壤細菌是第一大重要類群，約占到土壤微生物總量的70%～90%。土壤細菌在生物地球化學循環過程中發揮著重要作用［11］：驅動和調控土壤中各養分元素的礦化、降解和轉化等生物學過程，對植物生長和生物產量也產生重要影響［12］；直接參與土壤中氮素的氨化、硝化、反硝化和生物固持等生物化學過程［13］，對土壤有機質降解和土壤碳循環過程也發揮關鍵作用［14］。因而，土壤細菌群落組成及生物多樣性成為諸多學者關注和研究的焦點［15］。

Biolog-ECO微平板檢測法［16］、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）指紋圖譜技術［17］和磷脂脂肪酸（phosphohpids fatty acids，PLFA）生物標記法［18］等技術在鑒定土壤細菌群落組成、功能及生物多樣性等方面已得到廣泛應用。而高通量測序技術［19］以其高通量、低成本、準確率高和數據信息量大等優勢，被廣泛應用于鑒定和分析土壤細菌群落結構及生物多樣性。因此，本研究選擇關帝山林區3種典型退化草地植被群落類型為研究對象，采用高通量測序技術分析不同退化程度草地土壤細菌群落組成及生物多樣性的空間分布格局及差異性特征，為闡明土壤細菌群落在草地生態系統土壤碳、氮等養分代謝循環過程中的重要調控機理提供科學依據，對揭示關帝山林區草地生態系統地下部分的生物與環境因子格局及生態學過程起到了重要的實踐指導意義。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

樣地位于呂梁山脈中段關帝山林區的山西省龐泉溝國家級自然保護區內，該區域屬于典型暖溫帶大陸性季風氣候，植物資源豐富，生物多樣性較高，年平均氣溫4.2℃，無霜期100～125 d，年降雨量822.6 mm，且集中于7～9月，海拔梯度1 600～2 831 m。土壤類型呈垂直分布帶，自下而上依次為：黃綿土、山地褐土、山地淋溶褐土、山地棕壤和亞高山草甸土。選取3種具代表性的典型草地群落類型作為研究對象，各類型草地存在不同程度退化，根據張金屯［6］山西高原草地退化分級劃分標準，結合牲畜放牧、人類干擾及植物種類組成和土壤狀況，將退化系列劃分為輕度退化草地（light degrade grass land，LDG）、中度退化草地（medium degrade grass land，MDG）和重度退化草地（heavy degrade grass land，HDG）。各個樣地的詳細的特征如表1所示。

同時，在每種草地群落類型樣地內分別設置3個2 m×2 m的樣方，樣方間距大于10 m。采用混合多點取樣法分別采集0～10 cm（A層）和10～20 cm（B層）土壤樣品，并進行過篩（2 mm）去除動植物殘體和雜質等。采用四分法留取混合土樣約10 g，然后使用50 mL離心管裝封并放入液氮及冰盒中攜帶回實驗室，放置于-80℃冰箱內以備提取土壤DNA。

1.2 細菌16S rRNA基因測序

土壤細菌群落組成及生物多樣性采用第二代高通量測序平臺（Illumina Miseq）進行測序分析。其中，PCR擴增引物為：520F（5'-GCACCTAAYTGGGY-DTAAAGNG-3'）和 802R（5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR擴增反應體系：2μL的純化DNA，5μL的Q5反應緩沖液（5×），5μL的Q5高保真GC緩沖液（5×），0.25μL的Q5高保真DNA聚合酶（5 U/μL），2μL的dNTPs液（2.5 mmol/L），上游引物和下游引物（10μmol/L）各1μL，8.75μL的去離子水。PCR擴增反應條件：98℃預變性2 min；98℃變性15 s；55℃退火30 s；72℃延伸 30 s，27個循環；最后 72℃延伸 5 min。PCR擴增產物在4℃保存，并用Agencourt AMPure Beads （Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA）試劑盒純化處理，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）檢測試劑盒對擴增產物進行熒光定量分析。Illumina MiSeq高通量測序和分析委托上海派森諾生物科技有限公司進行。

表1 不同退化程度草地群落類型主要特征Tab.1 Main features of different degeneration grassland community types

1.3 數據統計分析

測序序列數據分析主要采用QIIME和R軟件包（v3.6.3）進行，不同草地群落類型的土壤細菌群落組成聚類熱圖分析和α多樣性（Chao1和Shannon）均根據操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣列表中各樣本物種相對豐度計算獲得，使用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Somers，NY，USA）軟件對細菌群落生物多樣性及優勢菌群相對豐度進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）和多重比較，采用95%置信水平上Turkey-HSD檢驗進行差異性顯著的認定。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌群落α多樣性

不同退化程度草地群落類型和土層土壤細菌群落生物多樣性存在顯著性差異（圖1）。其中，重度退化的苔草草地群落類型（Carex stenophylloidesgrassland，CS）表層土壤（0～10 cm）細菌群落α多樣性（Chao1和Shannon指數）最高，輕度退化的蒿草草地群落類型（Kobresia grassland，KG）底層土壤（10～20 cm）細菌群落α多樣性最低；同一草地群落類型不同土層之間土壤細菌群落α多樣性也差異性顯著（Shannon指數），輕度退化的KG和重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）細菌群落α多樣性顯著高于底層土壤（10～20 cm），而中度退化的沙棘灌叢草地群落類型（Hippophae rhamnoidesshrubs grassland，HR）土壤細菌群落α多樣性底層土壤（10～20 cm）顯著高于表層土壤（0～10 cm）。

圖1 不同草地類型和土層土壤細菌群落α多樣性分析Fig.1 Soil bacterial community alpha diversity among different grassland community types and soil layers

2.2 土壤細菌群落組成及優勢菌群

不同退化程度草地群落類型和土層土壤細菌群落組成及優勢菌群相對豐度含量存在顯著性差異。由圖2可知：相對豐度含量排名前十的細菌門中，變形菌門（Proteobacteria）和藍細菌門（Cyanobacteria）在輕度退化的KG底層土壤（10～20 cm）中相對豐度含量最高，顯著高于其他草地群落類型和土層，屬于明顯的優勢菌群；浮霉菌門（Planctomycetes）和迷蹤菌門（Elusimicrobia）在輕度退化的KG表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量最高；芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）在重度退化的CS底層土壤（10～20 cm）中相對豐度含量最高；酸桿菌門（Acidobacteria）在輕度退化的KG表層土壤（0～10 cm）和中度退化的HR底層土壤（10～20 cm）中相對豐度含量最高，且二者之間差異性不顯著；放線菌門（Actinobacteria）在中度退化的HR表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量最高；硝化螺旋菌門（Nitrospirae）在KG表層土壤（0～10 cm）、HR底層土壤（10～20 cm）和CS底層土壤（10～20 cm）中相對豐度含量最高，且相互之間差異性不顯著；綠彎菌門（Chloroflexi）在重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量最高，顯著高于其它草地群落類型和土層，屬于明顯的優勢菌群；擬桿菌門（Bacteroidetes）在KG表層土壤（0～10 cm）和HR表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量最高，且二者之間差異性不顯著。

圖2 不同草地類型和土層土壤細菌優勢菌群相對豐度含量分析Fig.2 Relative abundance of soil bacterial dominant phyla among different grassland community types and soil layers

由表2可知：相對豐度含量排名前十的細菌屬中，涅瓦河菌屬（Nevskia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、乳酸球菌屬（Lactococcus）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）和無色桿菌屬（Achromobacter）6個屬，在輕度退化的KG底層土壤（10～20 cm）中相對豐度含量最高，顯著高于其它草地群落類型和土層，屬于明顯的優勢菌群；紅游動菌屬（Rhodoplanes）在中度退化的HR底層土壤（10～20 cm）中相對豐度含量最高；節桿菌屬（Arthrobacter）在重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量最高，顯著高于其它草地群落類型和土層，屬于明顯的優勢細菌屬；浮霉狀菌屬（Planctomyces）在輕度退化的KG表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量最高，且與HR表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量差異不顯著；小月菌屬（Microlunatus）在輕度退化的KG底層土壤（10～20 cm）和重度退化的CS表層土壤（0～10 cm）中相對豐度含量最高，且二者之間差異性不顯著。

表2 不同草地類型和土層土壤細菌優勢菌屬相對豐度含量Tab.2 Relative abundance of soil bacterial dominant genera among different grassland community types and soil layers

同時，根據不同草地群落類型和土層土壤細菌優勢屬聚類和熱圖分析可知（圖3），6個樣本聚類為兩大類群，即：不同草地群落類型的表層土壤（0～10 cm）和底層土壤（10～20 cm）類群。輕度退化的KG和中度退化的HR在同一土層深度土壤中細菌群落組成相似度較高，但不同土層深度之間土壤細菌群落組成差異性顯著。重度退化的CS與輕度退化的KG、中度退化的HR相比較，在不同土層深度土壤中細菌群落組成差異較大，且不同土層深度之間差異性顯著。

3 討論

土壤細菌是草地生態系統物質循環和能量流動的主要驅動因子，其群落組成及生物多樣性對土壤肥力、理化性質及土壤健康狀況等產生重要影響［20］。本研究結果表明，不同退化程度草地群落的土壤細菌α多樣性存在顯著性差異，且土層深度因素也顯著影響土壤細菌的α多樣性（圖1）。Tardy等［21］的研究表明土壤細菌群落生物多樣性決定著土壤細菌群落結構及其生態服務功能。此外，Fierer等［22］的研究揭示了土壤細菌群落對土壤環境中各生態因子也產生了相應作用。土壤細菌群落受氣候變化、干擾程度、草地類型及植物群落組成等因素的影響，會直接參與土壤有機質的形成和降解過程，對土壤中有機質含量產生重要影響［23-24］。重度退化的苔草草地表層土壤細菌α多樣性最高（圖1），其高豐度含量的節桿菌屬（Arthrobacter）（表2）具有很強的抗旱性和耐餓性，可降解土壤中的有機化合物質，使得土壤有機質含量降低［25］，從而引起土壤退化及草地生態系統退化。同時，牲畜放牧［26］和人為干擾［27］等外因會顯著影響和改變土壤細菌種群數量、群落結構及生物多樣性，引起土壤硬度和有機質含量等土壤理化特性發生變化，造成土壤退化［20］。

圖3 不同草地群落類型和土層土壤細菌優勢屬聚類熱圖Fig.3 Heat map and cluster of soil bacterial dominant genera among different grassland community types and soil layers

“缺氮”是退化草地土壤環境養分失衡的重要表現形式之一，其嚴重制約著退化草地生態系統的恢復和平衡［9］。而土壤細菌直接參與土壤氮素養分的循環與轉化過程，決定著土壤肥力的高低及健康狀況［28］，對植物的生長發育和群落演替產生重要影響［29］。本研究結果相對豐度排名前十的土壤細菌門（屬）中多數是土壤反硝化細菌［綠彎菌門（Chloroflexi）、節桿菌屬（Arthrobacter）等］，其相對豐度含量隨草地退化程度增加而顯著增高（圖2和表2），其主導的反硝化作用易引起土壤中氮素養分流失，造成土壤“缺氮”和加速草地退化［30-31］。而芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）屬于革蘭氏陰性細菌，能利用和降解土壤中的主要碳源物質，可顯著降低土壤有機質含量［32］，其相對豐度含量在重度退化的苔草草地底層土壤中最高，表明由土壤細菌活動導致土壤有機質含量降低可能是引起關帝山林區草地退化的主要原因之一。

同時，本研究還發現土層深度因素對關帝山林區草地土壤細菌群落組成及生物多樣性影響差異性顯著，這與前人研究結果一致，主要是由于土壤有機質和養分含量等生態因子隨土層深度增加而顯著降低的緣故［33］。