激活JNK后對神經膠質瘤抑瘤效果的探究

姜瑞芬，譚擁軍，黃明敏

（湖南大學生物學院，長沙 410082）

c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）是一種Ser/Thr蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族。JNK激酶家族包括3種蛋白質（JNK1、JNK2和JNK3），JNK蛋白行使功能必須要處于激活的磷酸化狀態［6］。當細胞受到藥物、細胞因子或其他外界應激的刺激后，JNK蛋白會被磷酸化。激活后的JNK磷酸化特定底物上的絲氨酸和蘇氨酸殘基，引起細胞功能發生改變，包括對細胞增殖、凋亡、炎癥等的影響［7］。而JNK的核底物中大部分為轉錄因子，JNK可以直接結合到下游轉錄因子的啟動子區域改變其轉錄活性，或直接磷酸化修飾該因子，引起其下游基因的表達變化［8］。JNK是調節許多生理過程的主要蛋白激酶，包括炎癥反應、形態發生、細胞增殖、分化、存活和凋亡等方面［9］。另外，JNK的持續活化與癌癥的發生發展有關。已有文獻表明，JNK在肝癌、皮膚癌、乳腺癌中發揮重要作用［10-12］，因此可以作為治療某些疾病的靶點。

茴香霉素（anisomycin，ANS）是JNK的經典激動劑，可誘導多種細胞內JNK的磷酸化，使其轉化為活性狀態［13-14］。本文通過使用JNK激動劑的方式，對神經膠質瘤U251細胞中的磷酸化JNK（phospho-JNK，P-JNK）進行有效的調節，探究JNK激活后對神經膠質瘤的發生發展是否起到關鍵作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

神經膠質瘤細胞U251來源于中南大學湘雅附屬醫院神經退行性疾病實驗室；Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）以及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購買自美國GIBCO公司；ANS購買自中國碧云天公司；P-JNK抗體購自美國CST公司，JNK和β-actin抗體購買于英國abcam公司，Rabbit和mouse二抗購買于中國碧云天公司；反轉錄PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物由長沙擎科公司合成；RNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司，逆轉錄試劑盒來自美國Thermo Fisher公司。

CO2細胞培養箱購買于美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購買自日本Nikon公司；凝膠成像分析系統購自上海天能公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems 公司；微孔板檢測儀（酶標儀）購自上海美谷分子儀器有限公司；流式細胞儀購自于美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

人源神經膠質瘤細胞U251為貼壁生長的細胞，培養于含有10% FBS的DMEM培養基中，在37℃、5% CO2濃度培養條件的培養箱中培養，當細胞密度達到80%以上時，按照1:3的比例進行傳代，或者加茴香霉素進行藥物處理。

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1.2.2 在線網站篩選有JNK表達差異性的腫瘤模型

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個有效的癌癥數據在線分析和挖掘的網站，主要是基于TCGA數據庫中的相關癌癥數據進行分析。我們進入TCGA analysis界面，輸入要搜索的基因MAPK8（JNK1），分別與下面TCGA dataset中不同的腫瘤類型進行相關性和生存分析的篩選，找到最合適的腫瘤模型。

1.2.3 CCK-8檢測

將U251細胞接種于96孔板中，每個孔接種量約4 000個細胞。細胞培養12.0 h并完全貼壁后，在試驗組中加不同質量濃度的茴香霉素，對照組中加相應等體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作為對照，設置5組平行。48.0 h后將原培養基吸掉，每孔加入含10% CCK-8的新鮮培養基100μL，37℃培養箱中孵育1.0 h，在酶標儀中進行測值，計算細胞存活率。

1.2.4 細胞計數

將U251細胞接種于24孔板中，確保每個孔細胞數相同且密度小于10%。待細胞完全貼壁后，試驗組分別加入質量濃度為1.0μg/mL和3.0μg/mL的茴香霉素，對照組加入同等體積的DMSO作為對照，每組設置3組平行。分別在0、24.0、48.0、72.0 h時對每個孔進行臺盼藍染色并對活細胞進行細胞計數，從而觀察加藥后茴香霉素對細胞增殖的影響。

1.2.5 細胞周期檢測

將U251細胞接種于2個6 cm培養皿中，確保密度相同且待完全貼壁后，其中一皿用1.0μg/mL茴香霉素處理8.0 h作為試驗組，另一皿加相同體積的DMSO處理相同的時間作為對照組。將藥物處理后的2皿細胞消化下來制成單細胞懸液，進行碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，室溫避光孵育30 min；將染色完成的細胞吸打混勻，用篩網過濾到流式管內，再在流式細胞儀中進行上機檢測，得到的數據用flowjo軟件進行分析，從而得到細胞各周期變化的結果。

1.2.6 劃痕試驗

將細胞以50%以上密度接種于12孔板，每孔接種細胞數相等，培養12.0 h待細胞完全貼壁且鋪滿整個孔底后，將培養基吸掉并將12孔板倒置過來，在每個孔底平行的劃3條線。然后將12孔板正放，用無菌的200μL槍頭沿著孔底的橫線劃痕。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）將細胞沖洗2遍后加入新鮮培養基，試驗組同時加入1.0μg/mL的茴香霉素于37℃培養箱中進行培養。在加藥0 h和24.0 h后拍照，比較對照組和試驗組的傷口愈合能力。

1.2.7 蛋白質印跡法（Western blot）

未經任何處理的U251細胞為對照組，1.0μg/mL茴香霉素分別處理0、4.0、8.0、12.0 h的U251細胞為試驗組。把對照組和試驗組的細胞消化下來提取總蛋白，將處理好的樣品以每孔80μg的上樣量進行膠濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），再濕轉到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；將其置于室溫下5%的脫脂奶粉封閉2.0 h左右，在稀釋好的一抗中進行4℃孵育過夜；用含吐溫的Tris鹽緩沖液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜6次，每次5 min；再在對應的二抗中室溫孵育2.0 h，TBST洗膜6次，每次5 min；最后將洗好的膜放在凝膠成像儀上，滴加顯色液后進行顯影曝光并拍照。

1.2.8 RT-PCR

未經任何處理的U251細胞為對照組，1.0μg/mL茴香霉素分別處理0、4.0、8.0、12.0 h的U251細胞為試驗組。將對照組和試驗組的細胞加入Trizol后，用RNA提取試劑盒按照其說明書上的步驟進行RNA的提取，再用逆轉錄試劑盒將得到的RNA逆轉錄成cDNA。設計相關基因的反轉錄引物，10μL體系加樣，進行RT-PCR，以GAPDH基因的循環數作為內參。RT-PCR儀程序設置為三步法擴增程序（95℃5 min ；95℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，40 個循環 ；95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s，1 個循環）。相關基因的引物設計見表1。

表1 相關基因的qRT-PCR引物Tab.1 The qRT-PCR primers of related genes

1.2.9 轉錄組測序分析

將U251細胞接種于2個6 cm培養皿中，確保密度相同且待完全貼壁后，其中一皿用1μg/mL茴香霉素處理8.0 h后作為試驗組，另一皿加相同體積的DMSO處理相同的時間為對照組。在2個培養皿中加入1.5 mL Trizol直接裂解細胞，吹打均勻至無粘稠后加入經去RNA酶處理的EP（eppendorf）管中，凍于-80℃冰箱。將樣品寄送至上海美吉生物公司，進行RNA的抽提以及轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）的分析。

2 結果與分析

2.1 在線網站分析JNK與神經膠質瘤的發生發展之間具有很強的相關性

UALCAN是一個基于TCGA數據庫中的相關癌癥數據進行分析的在線網站。我們對JNK和不同腫瘤模型進行了相關性和生存分析比對，發現JNK1（MAPK8）基因與神經膠質瘤中的膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）之間的相關性最高（圖1a），并且JNK1與神經膠質瘤的預后有關（圖1b）。因此，我們選擇了神經膠質瘤細胞U251作為試驗開展的細胞模型。

圖1 在線網站分析JNK與神經膠質瘤之間的相關性Fig.1 Analysis of the correlation between JNK and gliomas via an online website

2.2 JNK被激活的最適條件探究

將U251細胞傳代至6 cm培養皿中，保證每皿細胞密度相同。待細胞完全貼壁后，在4皿細胞中分別加入不同質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL）的茴香霉素作為試驗組，另一皿空白細胞中加入DMSO作為對照組。培養箱放置1 h后，收集蛋白，做Western blot檢測，試驗結果表明茴香霉素質量濃度為1.0μg/mL時激活JNK效果最好，具體結果如圖2a所示。同樣的方法傳代細胞，DMSO處理的為對照組，1μg/mL的茴香霉素分別處理不同時間（0.5、1.0、1.5 h）的細胞為試驗組。將蛋白收集，做Western blot檢測，發現茴香霉素處理細胞的時間為1.0 h時JNK的激活效果最好，結果如圖2b所示。因此可以得出結論，質量濃度為1μg/mL、處理時間為1.0 h的茴香霉素激活U251細胞中JNK的效果最好。

圖2 Western blot試驗探究激活JNK的最適條件Fig.2 Western blot experiments explore optimal conditions for activating JNK

2.3 激活JNK后能夠抑制U251的細胞增殖

取一皿密度較高的U251細胞，用1.0μg/mL的茴香霉素進行處理，分別在0 h（圖3a1）、24.0 h（圖3a2）、48.0 h（圖3a3）、72.0 h（圖3a4）時于顯微鏡下進行細胞形態學觀察并拍照。發現隨著茴香霉素處理時間的增加，原本呈長梭形的U251細胞逐漸皺縮變圓，且細胞間的連接增多，如圖3a所示。將U251細胞鋪96孔板后用不同質量濃度的茴香霉素處理，進行CCK-8檢測，發現在一定的范圍內，隨著茴香霉素質量濃度的增加，U251細胞的活力逐漸減弱，如圖3b所示。將U251細胞鋪24孔板，分別用1.0μg/mL、3.0μg/mL的茴香霉素處理細胞不同時間進行細胞計數檢測，發現隨著處理時間的增加，細胞增殖數逐漸降低，且3.0μg/mL處理的細胞比1.0μg/mL處理的細胞增殖數更低，如圖3c所示。1.0μg/mL茴香霉素分別處理1.0、8.0、12.0、24.0 h的U251細胞，分別提取RNA后逆轉錄成cDNA，進行qRT-PCR，發現隨著處理時間的增加，與增殖相關的增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Polo 樣激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）基因的mRNA表達量逐漸降低，如圖3d所示，且差異均具有統計學意義（P＜0.05）。同時，Western blot檢測發現PCNA、PLK1基因的蛋白表達量也逐漸降低，結果如圖3e所示。以上結果均說明了茴香霉素通過激活JNK有效抑制了U251細胞的細胞增殖。

2.4 激活JNK后能夠抑制U251細胞的遷移能力

將U251細胞鋪12孔板，待細胞密度達到100%時，進行劃痕試驗來分析細胞的運動能力。用DMSO處理的為對照組（圖4a1、4a2），用同體積1.0μg/mL茴香霉素處理的孔為試驗組（圖4a3、4a4），分別在0 h（圖4a1、4a3）、24.0 h（圖4a2、4a4）時觀察劃痕寬度的變化并拍照。試驗發現24.0 h后對照組細胞劃痕被分裂增殖的細胞愈合，寬度明顯變窄，而試驗組細胞劃痕寬度未出現任何變化（圖4a）。上述試驗結果表明，細胞內源JNK活性被激活后，U251細胞的遷移能力受到了顯著抑制。為了進一步揭示細胞遷移能力的變化，采用qRT-PCR分析了E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）的表達水平。E-cad是人黏附因子，其表達水平與細胞的遷移能力呈負相關［15］。試驗結果顯示，當JNK被激活后，E-cad基因的表達量隨之上升（圖4b），且差異均具有統計學意義（P＜0.05）。Western blot檢測，E-cad蛋白的表達量也呈現相同的趨勢（圖4c）。上述試驗說明在U251細胞中依靠藥物活化的JNK，抑制了U251細胞的遷移能力。

圖3 激活JNK后能夠抑制U251的細胞增殖Fig.3 Activated JNK can inhibits U251 cell proliferation

2.5 激活JNK后能夠引起U251細胞周期的阻滯

為了進一步分析激活后的JNK對于神經膠質瘤細胞U251的影響，接下來進行了細胞周期分析。將茴香霉素處理8.0 h和DMSO處理8.0 h的U251細胞收集下來，濾網過濾后上流式細胞儀，進行細胞周期檢測，并將所得數據用flowjo軟件進行分析。試驗結果發現，茴香霉素處理后的U251細胞 G0/G1期細胞比率增加，G2/M 期細胞比率減少，而S期細胞比率變化不明顯，如圖5a、5b所示。上述結果表明，在JNK被激活的條件下，U251細胞的周期被阻滯在G0/G1期。

圖4 激活JNK后能夠抑制U251細胞的遷移Fig.4 Activated JNK can inhibits U251 cell migration

2.6 RNA-seq分析尋找受JNK調節的下游轉錄因子

圖5 激活JNK后能夠引起U251細胞周期的阻滯Fig.5 Activated JNK can cause U251 cell cycle arrest

為了進一步探究JNK是如何引起U251細胞的功能發生變化，尋找受JNK調節的靶作用因子，揭示激活后的JNK對于神經膠質瘤起到抑瘤效果的分子機制，我們進行了RNA-seq分析。我們將嚴格按照要求處理的細胞送至上海美吉生物公司，進行RNA的抽提以及RNA-seq分析。得到的數據通過R studio軟件進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），富集到的P53和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路，恰好是已有文獻表明為JNK下游的通路，結果如圖6a、6b所示?？梢奟NA-seq得到的數據是可靠的。通過轉錄因子預測平臺，在對照組與試驗組中篩選出的有表達差異的轉錄因子中，挑選了常見的且與腫瘤相關的P53和 Fox head家族進行比對，發現P53家族的得分最高，如圖6c所示，因此我們推測受JNK調節的關鍵轉錄因子為P53。

3 討論

目前在所有的腦腫瘤中，神經膠質瘤的發病率占第一位，并且其發病率高，術后復發快且預后差，嚴重威脅著人類健康。由于傳統治療方式如手術、化療、放療等的治療效果難以使人滿意［16］，近年來研究者們對神經膠質瘤的研究逐漸趨向于不同通路的靶點治療，這使得人類從分子水平調控神經膠質瘤的發生、發展成為可能［17］。

JNK蛋白作為能夠調節細胞許多生理過程的主要蛋白激酶，在腫瘤的發生發展中起著至關重要的作用。但在不同類型的癌癥中，JNK行使的功能也不同。有文獻報道，JNK可以通過增強肝細胞增殖和促進新生血管形成而在肝癌中起到促癌作用，JNK途徑還可抑制乳腺癌的發展［18-19］。而對于神經膠質瘤來說，有研究表明，JNK與膠質母細胞瘤的干性相關［20］，并且JNK通路與神經膠質瘤的細胞凋亡也有關［21-22］。但具體JNK是否會對神經膠質瘤的發生發展產生影響，以及有怎樣的影響，這是本課題接下來將要開展的研究內容。

本文通過生物信息數據分析得出JNK與神經膠質瘤的發生和發展存在很強的相關性，通過使用茴香霉素實現對細胞內P-JNK水平的有效調節，利用Western blot試驗探究其發揮作用的最適條件是質量濃度為1.0μg/mL、時間為1.0 h。在此基礎上用茴香霉素處理U251細胞，通過CCK-8檢測、細胞計數、細胞劃痕和流式細胞檢測等試驗，發現激活JNK后能夠引起U251細胞的細胞增殖和遷移的抑制以及細胞周期的阻滯，從而達到抑瘤效果。本文通過激活JNK發現其能夠對神經膠質瘤產生抑瘤效果，為JNK可作為神經膠質瘤的治療靶點提供了依據；通過RNA-seq分析找到關鍵轉錄因子P53，為進一步探究JNK影響神經膠質瘤發生發展的調節機制提供了方向。

圖6 RNA-seq分析尋找受JNK調節的下游轉錄因子Fig.6 RNA-seq analysis to find downstream transcription factors regulated by activated JNK