日糧中添加沙棘果渣對肉羊肌內(nèi)脂肪沉積及其關(guān)鍵基因和酶活力的影響

鄧步皓，秦旭澤，張 婷，張建新，趙俊星

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）是廣泛分布于大西洋沿岸、蒙古以及我國西北部的落葉灌木，擁有較好的藥用價(jià)值和相關(guān)疾病的治療潛力［1］。由于含有酚類、黃酮類、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和植物甾醇等生物活性物質(zhì)，沙棘汁、沙棘果醬和沙棘油等均擁有很好的消炎、抗癌、抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)功能［2］。沙棘果渣（sea buckthorn pomace，SBP）是沙棘汁飲料生產(chǎn)中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，含有濃度較大的多種天然生物活性化合物［3］。Kaushal等［4］的研究結(jié)果證實(shí)，沙棘果實(shí)和種子等均被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。育肥豬日糧中添加SBP有效提高了動(dòng)物的生長性能、肉品質(zhì)，影響了肌肉中脂肪酸的分布［5］。肉雞日糧中添加沙棘黃酮可影響脂質(zhì)代謝，提高生長性能和改善脂肪沉積［6］。蛋雞攝入SBP后提高了產(chǎn)蛋量，改善了蛋黃顏色［7］。這些研究表明了SBP具有改善家畜的生理功能及生產(chǎn)性能的作用。

肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）是影響肉品質(zhì)和風(fēng)味兒的關(guān)鍵因素之一，其含量受到了遺傳、營養(yǎng)與飼養(yǎng)管理等諸多因素的影響［8］。現(xiàn)已證實(shí)，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化能力主要受過氧化物酶增殖激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋α（CCAAT-enhancer-binding protein alpha，C/EBPα）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT-enhancer-binding protein beta，C/EBPβ）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）、鋅指蛋白423（zinc finger protein 423，ZNF423）等關(guān)鍵相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［9］。同時(shí)，脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL）和脂蛋白脂酶（lipoprteinlipase，LPL）等脂肪酸合成與降解相關(guān)酶的活性也與 IMF含量相關(guān)［10］。

集約化肉羊生產(chǎn)方式下提高瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率的措施可能導(dǎo)致肉羊肌內(nèi)脂肪沉積能力下降，肉品質(zhì)降低［11］。因此，在不影響肉羊生長速度的前提下，適當(dāng)提高IMF含量是當(dāng)前肉羊生產(chǎn)過程中亟待解決的問題之一。鑒于沙棘活性物質(zhì)與脂質(zhì)代謝的關(guān)系［12］，日糧中添加SBP可能影響肉羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝。本試驗(yàn)旨在研究日糧中添加不同比例的SBP對肉羊IMF沉積的影響及其作用機(jī)制，為合理利用SBP提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。隨機(jī)選取4月齡、體重相近（22.2±0.9）kg的杜泊（♂）×小尾寒羊（♀）雜交公羊30只，平均分為3組，單欄飼養(yǎng)。試驗(yàn)開始前，受試動(dòng)物按體重0.2 mg/kg的劑量注射伊維菌素，消除寄生蟲。試驗(yàn)各組肉羊分別飼喂含不同水平SBP的飼料：0%SBP（對照組）、7.8%SBP（7.8SBP組）和16.0%SBP（16SBP組）。預(yù)試期10 d，正式試驗(yàn)70 d，每天08:00和16:00進(jìn)行飼喂，自由采食和飲水。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取背最長肌（longissimus muscle，LD）樣品，分別置于4℃冰箱、多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）及液氮中保存。試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平見參考文獻(xiàn)［13］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 剪切力測定

取厚度約2.54 cm的LD樣品，放置于沸水浴中處理，當(dāng)樣品中心溫度達(dá)到70℃時(shí)立即取出樣品冷卻至室溫，并于1℃條件下保存24 h。之后，使用鉆孔機(jī)取上述6塊圓柱形樣品（直徑為1.27 cm），剪切力測定儀（Mecmesin，West Sussex，英國）測定Warner-Bratzler剪切力（Warner-Bratzler shear force，WBSF）。

1.2.2 IMF 含量測定

采用索氏提取法測定LD中IMF含量［14］。將LD真空冷凍干燥至恒重，在索氏提取器中利用乙醚進(jìn)行粗脂肪分離。8 h后，將樣品取出、真空干燥并重新稱重。IMF含量由以下公式計(jì)算：

IMF%=［干燥前重量（g）-干燥后重量（g）］/［干燥前重量（g）］×100% 。

1.2.3 馬森（Masson）三色染色

經(jīng)4%的PFA（pH7.4）固定的LD樣品用于Masson三色染色分析。固定后的樣品連續(xù)經(jīng)過酒精脫水（70% 酒精，30 min ；80% 酒精，30 min ；95% 酒精，30 min，3次；100% 酒精，30 min，3次）、二甲苯透明（20 min，3次）、石蠟浸蠟（2 h，3次）后包埋，并用切片機(jī)（Leica RM 2265，德國）進(jìn)行石蠟切片。樣品（7μm）經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水后進(jìn)行三色染色。樣品置于顯微鏡下拍照（Leica DMi8，德國），其中每一樣品均隨機(jī)選取10個(gè)視野。

1.2.4 RNA提取和real time qPCR分析

LD樣品中的總RNA依據(jù)Trizol試劑（Sigma，Saint Louis，MO，美國）說明提取，總RNA濃度和完整性由 NanoDrop（NanoDrop Instruments，Delaware，美國）和瓊脂糖凝膠電泳共同確定。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA Co.，Ltd.Dalian，中國）合成cDNA，CFX RT-PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，California，美國）進(jìn)行real time qPCR分析。PCR循環(huán)參數(shù)如下：95℃，20 s；55℃，20 s；72℃，20 s，36個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。擴(kuò)增完成后，通過熔解曲線對產(chǎn)物純度進(jìn)行確認(rèn)，PRL13作為內(nèi)參基因。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.1.2 儀器。U3000高效液相色譜儀(配置DAD檢測器，美國戴安公司)；MS205DU電子分析天平(瑞士METTLERROLEDD公司)；EXceed-AC-24超純水機(jī)(成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備)；GT SONIC-P3超聲波清洗儀(固特超聲股份有限公司)。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析

取100 mg LD樣品，溶解于500μL預(yù)冷裂解液中勻漿后，4℃14 000 r/min離心15 min。裂解液成分如下：20 mmol/L 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）（pH 7.4），2% 十二烷基苯磺酸鈉（SDS），1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），5.0 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），5.0 mmol/L 乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），100 mmol/L 氟化鈉（NaF），2 mmol/L 偏釩酸鈉（NaVO3），0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）。取上清液，并與等體積的上樣緩沖液（150 mmol/L Tris-HCl，20% 甘油，2 mmol/L的2-巰基乙醇，0.004%的溴酚藍(lán)）混合后煮沸備用。制備好的蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulhtate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（BIO-RAD，美國）、NC 膜轉(zhuǎn)膜（BIO-RAD，美國）、封閉（脫脂奶粉）后加入相應(yīng)的一抗與二抗。蛋白定量使用Odyssey遠(yuǎn)紅外掃描系統(tǒng)（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，美國）完成。其中β-tubulin表達(dá)量作為內(nèi)參蛋白。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time qPCR

本研究所用抗體信息如下：FABP4（bs-4059R），SREBP1（bs-1402R），CCAAT/enhancer-binding protein α（C/EBPα，bs-1630R），CCAAT/enhancer-binding protein β（C/EBPβ，bs-1396R），peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ，bs-4590R），β-tubulin（bsm-33034M）購于中國博奧森公司；ACC（#3662）購于美國Cell Signaling公司；山羊抗小鼠二抗（goat antimouse secondary antibody，926-68070）與山羊抗兔二抗goat anti-rabbit secondary antibody，926-32211）均購于美國LI-COR公司。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）分析

將500 mg LD樣品加入4.5 mL pH為7.4的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，并在冰上進(jìn)行勻漿，4℃、2 500 r/min離心20 min后取上清，用于酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析。試驗(yàn)所用試劑盒信息如下：FAS（ml03668）、ACC（ml036689）、MDH（ml036689）、LPL（ml025647）、HSL（ml036706）均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)中，組內(nèi)每只肉羊均作為一個(gè)試驗(yàn)單位，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件（Monrovia，CA，USA）進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重分析。P＜0.05則認(rèn)為是差異顯著，P＜0.01則認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧中添加SBP對肉羊LD剪切力的影響

剪切力是反應(yīng)羊肉嫩度的重要指標(biāo)。如圖1所示，與對照組相比，肉羊日糧中添加7.8%SBP和16%SBP均可以極顯著降低LD中WBSF（P＜0.01）。

圖1 日糧中添加SBP對肉羊LD中WBSF的影響Fig.1 The effects of different dietary SBP level on WBSF in LD muscle in lambs

2.2 日糧中添加SBP對LD中IMF的影響

2.3 日糧中添加SBP對脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

如圖3a所示，日糧中添加16%SBP可顯著提高ZFN423的mRNA水平（P＜0.05）。與對照組相比，C/EBPα（圖3b，P＜0.01）與PPARγ（圖3c，P＜0.05）的mRNA表達(dá)極顯著或顯著上升。Western blot的結(jié)果顯示，16SBP組中轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα的蛋白含量顯著上升（圖3d、3e，P＜0.05），而C/EBPβ蛋白含量未見顯著變化（圖3f）。

圖2 日糧中添加SBP對肉羊LD中IMF的影響Fig.2 The effects of different dietary SBP level on IMF content in LD muscle in lambs

2.4 日糧中添加SBP對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對照組相比，16SBP組肉羊LD中SREBP1的表達(dá)在mRNA（圖4a，P＜0.05）與蛋白水平（圖4b，P＜0.05）均顯著高于其他兩組。如圖4c、4d所示，日糧中添加SBP未顯著影響FABP4的表達(dá)水平。與對照組相比，日糧中添加16%SBP可顯著增加FAS的mRNA水平（圖4e，P＜0.05）。如圖4f顯示，日糧中添加7.8%SBP和16%SBP均可以顯著增加ACC的含量（P＜0.05）。

2.5 不同SBP水平對LD中脂肪代謝相關(guān)酶活力的影響

表2 日糧中添加SBP對肉羊LD中脂肪酸代謝相關(guān)酶活性的影響Tab.2 Effect of dietary SBP supplementation on fatty acid metabolism-related enzyme activities in Longissimus thoracis et lumborum muscle of lambs

圖3 日糧中添加SBP對肉羊LD中脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響Fig.3 The effects of different dietary SBP level on adipogenesis related transcriptional factor expression LD muscle in lambs

圖4 日糧中添加SBP對肉羊LD中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 The effects of different dietary SBP level on the enzymes expression of lipid metabolism

如表2所示，與對照組相比，7.8SBP與16SBP組中的FAS活性顯著升高（P＜0.05），而ACC的活性在16SBP組中顯著高于其他兩組（P＜0.05）。日糧中添加SBP未改變LD中的MDH活性。與對照組相比，16SBP組中的HSL均顯著降低（P＜0.05），而LPL未見顯著差異。

3 討論

隨著羊肉消費(fèi)市場的成熟，消費(fèi)者對優(yōu)質(zhì)羊肉的需求逐漸增加。嫩度是決定羊肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一［15］，其高低受到了動(dòng)物品種、營養(yǎng)水平、飼養(yǎng)管理、養(yǎng)殖環(huán)境、宰前與宰后操作的影響［16］。WBSF是衡量肉嫩度的常用指標(biāo)之一，WBSF越小，肌肉嫩度越好。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加7.8%SBP即可以顯著降低WBSF，說明了SBP有提高羊肉嫩度的功能。黃酮是沙棘的重要活性成分之一。李垚等［17］在肉雞日糧中添加沙棘黃酮后發(fā)現(xiàn)了雞肉剪切力有下降趨勢，本研究進(jìn)一步證明了沙棘活性物質(zhì)與肉嫩度的相關(guān)性。

肌內(nèi)脂肪含量是決定肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，其含量的高低影響了羊肉的多汁性、適口性、肉風(fēng)味以及肉嫩度等指標(biāo)［18］。本試驗(yàn)測定了IMF含量，并證明了日糧中添加SBP顯著增加了IMF的含量。鑒于IMF對肉嫩度的貢獻(xiàn)，添加SBP導(dǎo)致的IMF含量升高解釋了WBSF降低的原因。與本試驗(yàn)結(jié)果類似的是，肉雞日糧中添加一定比例的沙棘黃酮可以有效降低腹脂率，降低血液中的甘油三酯、膽固醇以及低密度脂蛋白，有效地提高了胸肌中的IMF含量［6］。結(jié)合我們的結(jié)果推測，沙棘中可能存在影響脂質(zhì)代謝及肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的活性物質(zhì)。

動(dòng)物體內(nèi)脂肪組織可分為4大類，皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪［19］，其含量的高低受脂肪細(xì)胞分化能力與脂肪沉積能力的共同影響。在胚胎發(fā)育早期，肌肉纖維、肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞來源于一種常見的間充質(zhì)祖細(xì)胞群，在此期間形成肌源性或纖維/脂肪源性細(xì)胞譜系［20］。間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞經(jīng)過兩個(gè)階段，即決定與分化［21］，其中ZNF423在特化階段其關(guān)鍵作用，決定了脂肪前體細(xì)胞的形成［22］。ZNF423可以誘導(dǎo)PPARγ的表達(dá)，它可以誘導(dǎo)纖維脂肪祖細(xì)胞分化為前體脂肪細(xì)胞進(jìn)而分化為成熟的脂肪細(xì)胞。前人研究發(fā)現(xiàn)ZNF423在具有較高成脂能力的牛肌間質(zhì)血管中含量豐富，ZNF423的過量表達(dá)促進(jìn)了低脂細(xì)胞的成脂分化，反之亦然［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，16SBP組的ZNF423基因表達(dá)量顯著高于對照組，表明16SBP組肉羊LD有更高的前體脂肪細(xì)胞形成能力。脂肪細(xì)胞分化同時(shí)受到了C/EBPβ、C/EBPα和PPARγ等轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控，其中，C/EBPα直接與PPARγ基因的啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)其表達(dá)，并啟動(dòng)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，使前體細(xì)胞最終分化為成熟的脂肪細(xì)胞［24］。PPARγ是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子，其激動(dòng)劑（羅格列酮、噻唑烷二酮、吡格列酮等）通常對治療代謝功能障礙和糖尿病有效［25］。前人研究表明，飼料中添加噻唑烷二酮和吡格列酮可以顯著促進(jìn)育肥豬IMF的沉積，而不影響背膘厚［26］。本研究證實(shí)了日糧中添加沙棘果渣可有效提高C/EBPα和PPARγ的表達(dá)水平，說明了沙棘果渣有增加LD中肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的功能，具體的活性成分有待進(jìn)一步研究。

IMF含量的高低也與脂肪代謝能力相關(guān)。為了進(jìn)一步分析SBP增加LD中IMF的原因，本試驗(yàn)分析了與脂肪酸代謝相關(guān)酶類的表達(dá)量及活性。SREBP1與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的代謝密切相關(guān)，是諸多脂肪酸合成相關(guān)酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［27］。本研究結(jié)果證明了日糧中添加SBP可有效地促進(jìn)SREBP1的表達(dá)，而其下游基因ACC與FAS的表達(dá)也相應(yīng)增加。ACC和FAS均為脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，其中ACC 催化乙酰輔酶A的羧化反應(yīng)生成丙二酰輔酶A，而FAS催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成棕櫚酸酯［28-29］。本研究結(jié)果證明了日糧中添加16%SBP可顯著增加二者的酶活性。FABP4是一種脂肪酸結(jié)合蛋白，其表達(dá)高低與IMF含量及脂肪酸的合成能力呈正相關(guān)［30］。肉牛中的研究結(jié)果表明，F(xiàn)ABP4是影響牛肉嫩度和IMF沉積的重要候選基因之一［31］。本研究發(fā)現(xiàn)的日糧中SBP對LD中FABP4、ACC及FAS的調(diào)控作用證明了日糧中添加SBP可以促進(jìn)LD中脂肪細(xì)胞的脂肪酸合成。

除受合成影響外，IMF沉積能力與脂肪酸的分解有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加16%SBP可顯著降低HSL酶活力。由于HSL是脂肪酸分解的限速酶，可以將甘油三酯分解成游離脂肪酸、甘油二酯和甘油［32］，本結(jié)果說明了SBP可以抑制LD中脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸降解。雖然LPL可以將甘油三酯分解成脂肪酸和甘油，調(diào)控脂肪沉積［33］，但本研究未發(fā)現(xiàn)LPL活性受SBP調(diào)控。

綜上所述，日糧中添加16%的SBP可通過促進(jìn)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ZNF423、PPARγ和C/EBPα等的表達(dá)促進(jìn)LD中脂肪細(xì)胞形成。同時(shí)促進(jìn)ACC與FAS的酶活性，促進(jìn)甘油三酯合成，抑制HSL酶活性，從而抑制甘油三酯分解，最終促進(jìn)IMF的增加，降低肉嫩度。由于SBP中含有眾多的活性物質(zhì)，這些變化的轉(zhuǎn)錄因子及酶活性是受何種活性物質(zhì)調(diào)控尚待進(jìn)一步研究。