湯姆青霉的抗菌活性研究

趙文婧，翟飛紅，吳麗華，燕平梅，李 娜

（太原師范學院生物系，晉中 030619）

青霉（Penicillium）是自然界中一個非常重要的真菌類群，廣泛地存在于自然界中，空氣、土壤和腐爛的物質上均可發現其存在。它與人類的關系十分密切，其發酵產物等均可以用于抗生素的制備。眾所周知，青霉素主要是由產黃青霉（P.chrysogenum）產生的，它是最早被發現、最先被提純并最早應用于臨床的抗生素。灰黃青霉（P.griseofulvum）產生的灰黃霉素是抑制諸如腳蘚之類的真菌性皮膚病最好的抗生素。本實驗室從山西省汾陽混交林土壤中分離得到了一株湯姆青霉PT95菌株，該菌株能形成大量堅硬、沙粒狀的微菌核，并能在菌核內積累類胡蘿卜素。關于湯姆青霉PT95（P.thomiiPT95）菌株對氧脅迫的細胞響應前期已經做了詳細的研究［1］，研究發現PT95菌株在不良環境下可以分化形成菌核，同時啟動體內的各種抗氧化機制來抵御不良環境。如前所述，抗生素的制備很多都是從青霉菌代謝產物中提取出的，李浩華等［2］在海洋真菌湯姆青霉FS77（P.thomiiFS77）中做了相關的抗菌活性研究，發現P.thomiiFS77菌株的發酵液中存在抗菌物質［2］。為了證實青霉PT95菌株是否具有一定的抗菌性能，本文將采用牛津杯法和濾紙片法試驗對湯姆青霉PT95抑菌活性進行研究，從7種待測菌種中篩選出具有最佳抑菌效果的菌種，并以此作為后續研究的對象，進行最小抑菌質量濃度的測定以及培養基的優化，為湯姆青霉PT95在抗菌方面的進一步研究及其應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

湯姆青霉PT95保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agarose，PDA）培養基上。抑菌試驗指示菌株大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、黑根霉（Rhizopus nigricans）均保存于太原師范學院微生物學實驗室。

1.2 培養基

1.2.1 液體培養基

本試驗所用的液體培養基：乳酸菌MRS液體（lactobacilli DeMan-Rogosa-Sharpe broth，MRS broth）培養基、馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養基、牛肉膏蛋白胨液體培養基。

1.2.2 固體培養基

本試驗所用的固體培養基：MRS固體培養基、PDA培養基、牛肉膏蛋白胨培養基。

優化基礎培養基的配方：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，NaCl 3.00 g/L，瓊脂 20.00 g/L，pH7.0～7.2［3］。

1.3 研究方法

1.3.1 菌株的培養及樣品的制備

1.3.1.1 湯姆青霉PT95發酵液制備

用接種環挑取一環湯姆青霉PT95并接種于100 mL PDB培養基中，其中試驗組中加入濃度為0.03 mmol/mL的環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），對照組中不加 cAMP，分別置于25℃搖床中200 r/min振蕩培養5 d。在超凈臺無菌操作過濾掉菌絲體［4］，留湯姆青霉PT95發酵液備用。

1.3.1.2 指示菌株的活化

取植物乳桿菌、德氏乳桿菌保存液各100μL，分別接種于50 mL MRS液體培養基中；取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌保存液各100μL分別接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中；挑取枯草芽孢桿菌接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中。將上述接好菌的培養基全部置于37℃搖床中150 r/min振蕩培養24 h。

挑取適量黑根霉菌株接種于50 mL PDB培養基中，置于25℃搖床中150 r/min振蕩培養24 h。

挑取適量釀酒酵母菌株接種于50 mL PDB培養基中，置于30℃搖床中150 r/min振蕩培養24 h。

1.3.2 最佳抑菌效果菌株的篩選

1.3.2.1 濾紙片法檢測發酵液的抑菌活性

將直徑為1.2 cm的濾紙圓片高壓蒸汽滅菌后備用，用滅菌鑷子取滅菌濾紙片分別放入發酵上清液與無菌水中浸泡2 h備用。

吸取200μL活化好的各指示菌株分別放置于無菌培養皿中，待滅菌好的培養基冷卻至50℃左右時，再取25 mL不同的培養基倒入相應加入指示菌株的培養皿中。待平板凝固好后，取上述濾紙片（以無液體滴下為準）放置于培養基上，每個平板放4個濾紙片（其中3個加發酵液，1個加無菌水），4個濾紙片間距大致相等，在各指示菌株的最適培養溫度下分別培養 12～24 h。

1.3.2.2 牛津杯法檢測發酵液的抑菌活性

將若干牛津杯置于小燒杯中滅菌備用。吸取200μL活化好的各指示菌株分別置于冷卻后的無菌培養皿中，待滅菌好的培養基冷卻至50℃左右時，再取25 mL不同的培養基分別倒入相應加入指示菌株的培養皿中。待平板凝固好后，用滅菌鑷子夾取牛津杯放于培養基上，每個平板放4個牛津杯（其中3個加發酵液，1個加無菌水），4個牛津杯間距大致相等，然后吸取200μL發酵液或無菌水加入牛津杯中，在各指示菌株的最適培養溫度下培養12～24 h。

依據抑菌率大小，從上述供試的7種指示菌中篩選出具有最佳抑菌效果的菌株，并將其作為后續試驗的菌種。

抑菌率=（抑菌圈直徑-牛津杯直徑/濾紙片直徑）/抑菌圈直徑×100%。

1.3.3 最小抑菌質量濃度的測定

將湯姆青霉PT95的發酵液在50℃下旋轉蒸發，濃縮至原體積的1/5，然后加入95%乙醇進行沉淀，使發酵液最終濃度為75%，4℃冰箱放置2 d后離心，棄去沉淀，重復1次上述步驟，取上清液在50℃下濃縮成浸膏，冷卻干燥成凍干粉備用［5］。

準確稱取一定量的發酵液凍干粉用2.5%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）分別配制成質量濃度為5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16 mg/mL的樣品溶液［6-7］，并采用牛津杯法計算抑菌率來確定最小抑菌質量濃度。

1.3.4 培養基的優化

根據最佳抑菌效果菌種的篩選結果，在優化基礎培養基上對碳源、氮源和無機鹽進行篩選，通過測定抑菌率的大小對培養基進行優化。

1.3.4.1 最適碳源的篩選

分別以可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖代替優化基礎固體培養基中的葡萄糖作為唯一碳源［8］，用篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

1.3.4.2 最適氮源的篩選

分別以尿素、檸檬酸銨、氯化銨、磷酸二氫銨、硝酸銨、酵母膏替代優化基礎固體培養基中的蛋白胨作為唯一氮源。用篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

1.3.4.3 無機鹽的篩選

在優化基礎固體培養基中，分別加入KH2PO4、FeSO4、KH2PO4+FeSO4，加入的量均占其培養基總量的0.05%［9-10］，其他組分均相同，將篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

1.3.4.4 最適MgSO4·7H2O質量濃度的篩選

在優化的基礎固體培養基中，調節MgSO4·7H2O的質量濃度分別為0.10、0.20、0.30、0.40 g/L，其他成分保持一致［11］，將篩選的高抑菌活性菌株制備液體菌種，采用牛津杯法計算抑菌率的大小。

2 結果與分析

2.1 最佳抑菌效果菌株的篩選

采用濾紙片法和牛津杯法，利用十字交叉法測量抑菌圈的直徑，通過抑菌率公式計算抑菌率，根據抑菌率確定最佳抑菌效果的菌株。

從表1可以看出，枯草芽孢桿菌可以作為具有最佳抑菌效果的指示菌株，其抑菌率可以達到56.37%。湯姆青霉PT95發酵液對金黃色葡萄球菌、釀酒酵母以及大腸桿菌均有抑菌活性，但是均低于對枯草芽孢桿菌的抑菌活性。從表中數據可以初步推斷湯姆青霉PT95發酵液對德氏乳桿菌與植物乳桿菌可能有殺菌作用，對根霉沒有抑制作用。

從表1和表2可以看到，加了cAMP的試驗組與不加cAMP的對照組的湯姆青霉PT95發酵液結果基本相同，所以之后的一系列試驗均采取不加cAMP的湯姆青霉PT95發酵液作為后續研究的對象。

表1 發酵液對不同指示菌株抑菌率的分析（%）Tab.1 Analysis of bacteriostatic rate of fermentation broth to different indicator strains (%)

表2 發酵液對不同指示菌株的抑菌圈直徑（cm）Tab.2 Diameter of bacteriostatic circle of fermentation liquid to different indicator strains (cm)

圖1為采用牛津杯法和濾紙片法得到的對枯草芽孢桿菌的抑菌圖，其中圖1a和圖1d是沒有添加cAMP的抑菌圖，圖1b和圖1c是添加了cAMP的抑菌圖。

根據圖1培養皿中菌落形成情況以及抑菌圈的直徑進行判斷可知，牛津杯法較濾紙片法更適合抑菌試驗。牛津杯法可以更好地控制湯姆青霉PT95菌株發酵濾液的量，抑菌圈更接近圓形，更便于測量，能盡可能地減小試驗誤差。

圖1 兩種方法測定有無cAMP的發酵液對枯草芽孢桿菌的抑菌作用Fig.1 Two methods to determine the bacteriostatic effect of the fermentation liquid with or without cAMP on Bacillus subtilis

2.2 最小抑菌質量濃度的測定

對湯姆青霉PT95發酵液進行蒸發濃縮和冷凍干燥，得到的凍干粉為黏稠狀似膠質的棕黃色固體。對凍干粉進行最小抑菌質量濃度的試驗，從表3中可以看出，湯姆青霉PT95發酵液對枯草芽孢桿菌的最小抑菌質量濃度為0.64 mg/mL。

2.3 培養基的優化

通過上述試驗可確定枯草芽孢桿菌為具有最佳抑菌效果的菌種，選取其作為后續優化試驗的菌株。在優化基礎培養基上首先進行了抑菌試驗，枯草芽孢桿菌的抑菌率達到65.40%，接著進行了最適碳源、氮源、無機鹽的篩選。

2.3.1 最適碳源的篩選

用供試碳源代替優化基礎培養基中的葡萄糖，保持碳含量一致。供試碳源有可溶性淀粉、蔗糖、乳糖和麥芽糖4種，結果見圖2。

由圖2可以看出，不同碳源對湯姆青霉PT95菌株抑制枯草芽孢桿菌的生長均具有一定的影響。在其他組分均相同的情況下，以麥芽糖為碳源時的抑菌率最高，且抑菌率可達70%，高于優化基礎培養的抑菌率，其次為乳糖、蔗糖，而抑菌率最低的為可溶性淀粉。所以當以可溶性淀粉為碳源時，湯姆青霉PT95菌株對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最差。說明湯姆青霉PT95可以有效利用麥芽糖這一碳源產生一些抑菌活性物質，故可選取其作為最適碳源。

表3 發酵液提取樣品對枯草芽孢桿菌的最小抑菌質量濃度測定（mg/mL）Tab.3 Determination of the minimum inhibitory concentration of the sample extracted from fermentation filtrate to Bacillus subtilis（mg/mL）

圖2 最適碳源的篩選Fig.2 Selection of the most suitable carbon source

2.3.2 最適氮源的篩選

分別用磷酸二氫銨、尿素、檸檬酸銨、氯化銨、硝酸銨、酵母膏替代優化基礎固體培養基中的蛋白胨作為唯一氮源。

磷酸二氫銨、尿素、檸檬酸銨、氯化銨為供試氮源時，枯草芽孢桿菌幾乎不生長，說明枯草芽孢桿菌不能有效利用磷酸二氫銨、尿素、檸檬酸銨、氯化銨等無機氮來進行自身生長［11-14］。而以酵母膏為供試氮源時，枯草芽孢桿菌菌落生長均勻，但在牛津杯添加湯姆青霉PT95菌株發酵液后抑菌效果不是很明顯。這表明改變優化基礎培養基中的氮源并不能促進枯草芽孢桿菌的生長或提高抑菌率，因此優化基礎培養基中的蛋白胨即為最適氮源成分。

2.3.3 無機鹽的篩選

在優化基礎固體培養基中分別加入KH2PO4、FeSO4、KH2PO4+FeSO4，結果發現，在加入無機鹽的培養基中枯草芽孢桿菌長勢較差，這說明枯草芽孢桿菌不能有效利用這些無機鹽進行自身的生長繁殖，因此優化基礎固體培養基中無需加入無機鹽來提高抑菌率。

2.3.4 最適MgSO4·7H2O質量濃度的篩選

在優化基礎培養基上，湯姆青霉PT95菌株的抑菌率可以達到65.4%。在優化培養基上分別添加不同質量濃度的MgSO4·7H2O，如圖3所示。從圖3可得知，MgSO4·7H2O的質量濃度在0.30 g/L的情況下抑菌率最高，可以達到67.57%，隨著MgSO4·7H2O質量濃度的提高，其抑菌率開始下降，所以最適的MgSO4·7H2O質量濃度為0.30 g/L。

圖3 MgSO4·7H2O最適質量濃度的篩選Fig.3 Selection of the optimum concentration of MgSO4·7H2O

3 討論

王書錦等［15］從黃海、渤海、遼寧近海地區分離得到海洋真菌508株，已鑒定出20多株，主要為青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）等的菌種，其中10%以上菌種的發酵產物具有抗細菌或抗真菌的生物活性；黃菁菁等［16］從福建廈門、晉江及詔安沿海地區采集到的29個樣品中分離到390株真菌，有63.3%的菌株表現出了對一種或幾種指示菌具有拮抗作用，通過形態鑒定發現，這些菌株以青霉屬和曲霉屬為主。

微生物在其生命過程中產生的天然代謝產物是天然抗生素的重要來源，它具有在低濃度下選擇性地抑制或殺死它種生物或腫瘤細胞的能力。隨著抗生素的發展和應用，近年來倍受人們關注的兩個問題為：1）細菌及真菌耐藥性的增加致使抗生素的療效有所下降；2）一些不致病的菌成為條件致病菌，在臨床上有一定的威脅［13］。微生態活菌制劑主要以乳酸菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌為主，不僅具備與抗生素相似的調節腸道等功能，且不產生耐藥性、不傷身體，具有促生長之功效，是抗生素的理想替代者。而湯姆青霉PT95菌株是否也能代謝產生抗生素，這需要進行不斷的篩選優化等進一步的研究。

本研究通過選取7種常見的細菌或真菌作為指示菌株，采用牛津杯法和濾紙片法用湯姆青霉PT95的發酵液對這7種菌進行了抑菌活性試驗，發現湯姆青霉PT95發酵液中存在某些抑菌物質，尤其是對枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌活性，同時也獲得了抑菌試驗的最佳培養條件。以此為基礎，本文還采用牛津杯法測定了湯姆青霉PT95抑制枯草芽孢桿菌的最小質量濃度，并采用單因素試驗對培養基進行了優化。從試驗結果發現，湯姆青霉PT95菌株發酵液的凍干粉對枯草芽孢桿菌有抑菌活性，最小抑菌質量濃度為0.64 mg/mL。本研究結果表明優化培養有助于提高湯姆青霉PT95的抑菌活性，而其中的抑菌機理值得我們進一步深入研究。