黃原膠對Suc-Asn反應體系中5-羥甲基糠醛形成的影響

葉 倩，徐 寧，郭紅英*，秦 丹，譚興和，王 鋒，王仁才

（1.湖南農業大學 a.食品科技學院；b.園藝園林學院，長沙 410128；2.湖南省食用菌研究所，長沙 410013）

5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfural，5-HMF）純品為針狀晶體或粉末，具有甘菊花味，5-HMF易溶于甲醇、水、乙酸乙酯，可溶于氯仿、苯、乙醚，微溶于四氯化碳溶液，難溶于石油醚［1］，分子式為C6H6O3，結構如圖1所示。5-HMF主要是在熱加工食品（如烘焙、燒烤等）過程中產生的一種可以刺激呼吸道、眼睛、黏膜，引起皮膚過敏及腸道潰瘍的有害物質［2］，雖可對食品增色調香［3］，但卻具有一定的致癌性［4-5］。目前已知5-HMF的主要產生途徑有3種：焦糖化反應、果糖脫水和美拉德反應［6-7］。美拉德反應和焦糖化反應是形成食品風味及感官的主要來源，但又會產生一系列對人體有毒有害的物質，如5-HMF和丙烯酰胺等物質［8］。因此，如何有效抑制5-HMF在食品熱加工過程的產生至關重要。

圖1 5-羥甲基糠醛的化學結構Fig.1 The chemical structure of 5-HMF

黃原膠（xanthan gum），又稱漢生膠或黃桿菌膠，屬于微生物膠，顏色為淺黃色或白色，易溶于水，具有穩定、乳化、膠凝等作用，常用于食品工業生產［9］。陳季旺課題組［10-12］先后研究了于外裹糊配方中添加黃原膠對油炸外裹糊魚塊的丙烯酰胺、油脂、水分等含量和感官品質的影響，試驗結果表明黃原膠對油炸外裹糊魚塊的丙烯酰胺含量、色度和質構、水分蒸發和油脂吸收等均有顯著影響。現有較新研究顯示，5-HMF可參與丙烯酰胺的生成，其生成機理是葡萄糖在熱反應條件下脫水生成3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG），進一步脫水生成3，4-DG和5-HMF，這些羰基化合物都可與天冬酰胺反應生成丙烯酰胺［13-14］。且多項試驗報道了溫度和pH值對黃原膠的流變性和黏度的影響較小［15-16］。因此本試驗采用蔗糖（Suc）和天冬酰胺（Asn）為主要反應底物，建立美拉德模擬反應體系，通過改變反應條件等方法探究黃原膠對體系中5-HMF形成的影響，旨在為降低熱處理食品中有害物質5-HMF的產生提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸（分析純）購于武漢市江北化學試劑有限責任公司；5-羥甲基糠醛標準品購于SIGMA公司；蔗糖（分析純）、L-天冬酰胺（生化試劑）、黃原膠（化學純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購于國藥集團化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

CP214型電子天平購于奧豪斯儀器上海有限公司；VORTEX-5型漩渦振蕩儀購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司；722S型可見分光光度計購于上海菁華科技儀器有限公司；Waters e2695型高效液相色譜儀購于美國Waters公司；SHZ-DⅢ型循環水系真空泵購于鞏義市予華儀器有限公司；TGW16型臺式高速微量離心機購于長沙英泰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 建立Suc-Asn反應體系

準確稱取0.342 3 g蔗糖和0.264 2 g天冬酰胺于250 mL圓底燒瓶中，再加入0.5%乳酸溶液100μL和300μL不同質量濃度的黃原膠溶液，充分混合，密封后置于160℃油浴鍋中反應10 min后取出，水冷卻3 min，加3.0 mL超純水，渦旋1 min，過膜（0.45μm）后待測。

1.2.2 單因素試驗

按1.2.1建立Suc-Asn反應體系，以抗氧化能力、褐變度、5-羥甲基糠醛含量為優化指標，探究影響體系中5-HMF生成的因素。配方設計：1）固定反應時間10 min、黃原膠質量分數0.3%、pH值為7，考察不同反應溫度（120、140、160、180、200℃）對體系中5-HMF形成的影響；2）固定反應溫度160℃、黃原膠質量分數0.3%、pH值為7，考察不同反應時間（4、6、8、10、12、14、16 min）對體系中5-HMF形成的影響；3）固定反應時間為10 min、反應溫度為160℃、pH值為7，考察不同質量分數的黃原膠溶液（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對體系中5-HMF形成的影響；4）固定反應時間10 min、黃原膠質量分數0.3%、反應溫度160℃，考察不同 pH 值（1、2、3、4、5、6、7、8）對體系中5-HMF形成的影響。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗基礎上，確定各反應條件的影響范圍，進行正交試驗。

1.3 測定方法

1.3.1 抗氧化能力的測定

參照郭紅英［17］和 Mohsen等［18］的方法，配制濃度為6.5×10-4mol/L的DPPH-甲醇溶液作為母液，用50%甲醇將母液稀釋10倍，按表1進行反應，并于DPPH溶液的最大吸收波長517 nm測A0、Ai、Aj所表示樣品的吸光度值（注：Ai所表示的樣品需在室溫下反應30 min后方可進行吸光度的測定）。每個試樣做3個平行試驗，取其平均值。

表1 DPPH試驗加樣（mL）Tab.1 Volumes of ingredients for DPPH test (mL)

樣品對DPPH自由基的清除能力（scavenging activity，SA）表示為：

其中，A0：DPPH與溶劑混合液的吸光度；Ai：DPPH與樣品反應后的吸光度；Aj：樣品與溶劑混合液的吸光度。

1.3.2 5 -HMF的測定

參照 Zhang 等［19］和張玉玉等［20］的方法進行5-HMF的測定。5-HMF標曲配制：將5-HMF標準品用10%甲醇溶液配制成0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L的不同質量濃度的標準溶液（現用現配）。檢測條件：色譜柱Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Agilent TC-C18保護柱；流動相為乙腈和0.1%甲酸水溶液（V乙睛∶V0.1%甲酸=10∶90）；流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進樣量為10μL；二極管陣列檢測器波長為285 nm。5-HMF標準樣品不同質量濃度的色譜圖如圖2所示。根據檢測樣品中5-HMF色譜峰面積及其相對應的質量濃度，從而可計算出樣品中5-HMF的含量，以5-HMF的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程y=16 212x+832.35，R2=0.999 8，表明5-HMF質量濃度與色譜峰面積線性關系良好。

圖2 5-HMF標準HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 5-HMF standards

1.3.3 褐變度的測定

將樣品稀釋20倍，用分光光度計在420 nm波長下測定其吸光值［21］。每個樣品做3次平行試驗，取平均值。

1.4 數據分析

采用 Excel 2010 和SPSS 18.0軟件對數據進行差異性統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 反應溫度對Suc-Asn反應體系的影響

反應溫度對Suc-Asn反應體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表2所示。5-HMF生成量隨反應溫度的升高呈現先增加后趨于平穩的趨勢。當反應溫度高于140℃時，5-HMF生成量得到顯著性提升，160℃時5-HMF含量僅為3.81 mg/L，當溫度為200℃時5-HMF含量達到最大值73.63 mg/L，此時可達最大抑制率66.73%。DPPH自由基清除能力隨反應溫度升高而加強，最大可達92.73%，褐變度也達最大值，這可能是由于當反應溫度較低時，蔗糖與天冬酰胺未能反應完全，此時5-HMF的形成是一個累加的過程，隨著反應溫度的繼續升高，5-HMF的累加速度受到抑制，聚合或分解反應加劇［22］，所以5-HMF的含量會趨于平穩，體系抗氧化能力增強，類黑素與焦糖色素的生成量也隨之增加，致使褐變度增加。

2.1.2 反應時間對Suc-Asn反應體系的影響

反應時間對Suc-Asn反應體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表3所示。5-HMF含量隨著反應時間的延長呈顯著性增長趨勢，在12 min時抑制率可達75.39%。隨著反應時間的延長，DPPH抗氧化能力呈現先緩慢增加至趨于平穩后降低的趨勢，在12 min時達到最大值，這一結果與涂宗財等［23］研究的樣品經高溫長時間熱處理導致抗氧化活性降低的結論一致。吸光值隨反應時間的增加而增加，在16 min時吸光值達到最大值，反應前期，由于時間相對較短，美拉德產物產出量相對較少，隨著反應時間的增加，產物量得到積累［24］，致使褐變度增加。

表2 反應溫度對Suc-Asn反應體系的影響Tab.2 Effect of reaction temperature on Suc-Asn reaction system

表3 反應時間對Suc-Asn反應體系的影響Tab.3 Effect of reaction time on Suc-Asn reaction system

2.1.3 黃原膠質量濃度對Suc-Asn反應體系的影響

黃原膠質量濃度對Suc-Asn反應體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表4所示。反應產物5-HMF生成量、褐變度隨著添加黃原膠質量濃度的升高而降低，而樣品對DPPH自由基的清除能力呈現先增大后降低的趨勢，在添加黃原膠質量分數為0.3%時達到最大值。5-HMF生成量的變化趨勢說明，不同質量濃度的黃原膠溶液可顯著抑制反應產物5-HMF的生成，其抑制機理可能是因為添加黃原膠質量濃度增大，溶液黏稠度隨之增加，體系流動性降低，此時反應底物被包埋，不利于美拉德反應的進行，從而抑制5-HMF的生成。

表4 黃原膠質量濃度對Suc-Asn反應體系的影響Tab.4 Effect of xanthan concentration on Suc-Asn reaction system

2.1.4 pH值對Suc-Asn反應體系的影響

pH值對Suc-Asn反應體系中5-HMF生成量、DPPH自由基清除能力和褐變度的影響如表5所示。5-HMF生成量隨pH值的增加呈現先降低后增加再降低的變化趨勢，在pH值為3時達到最低值0.29 mg/L，此時抑制率為96.35%，當pH值為7時5-HMF含量僅為0.31 mg/L。DPPH自由基清除能力隨著pH值的增加呈現先增加后降低再增加的變化趨勢，在pH值為3和8時DPPH自由基清除能力分別為88.89%和86.87%。吸光值隨pH值的增加呈先降低后增高再降低的顯著性波動變化趨勢。高pH值既有助于羰氨縮合使反應產物增加，又有助于糠醛類物質重排成還原酮類產物。故5-HMF含量和DPPH自由基清除能力相對較高［25］。

表5 pH值對Suc-Asn反應體系的影響Tab.5 Effect of pH value on Suc-Asn reaction system

2.2 Suc-Asn反應體系檢測指標的相關性分析

對Suc-Asn反應體系在160℃下不同反應時間的樣品5-HMF含量、褐變度以及抗氧化能力進行相關性分析，相關系數r可以反映兩個變量間的相關密切程度。本試驗中判斷兩變量相關密切程度的具體標準為：0＜∣r∣＜0.3表明微弱相關；0.3＜∣r∣＜0.5表明低度相關 ；0.5＜∣r∣＜0.8表明顯著相關；0.8＜∣r∣＜1.0表明高度相關。

由表6可知，5-HMF含量與褐變度的相關系數最大，呈高度相關，其次是褐變度與抗氧化能力的相關系數，最后為5-HMF與抗氧化能力低度相關。褐變度能衡量美拉德反應的程度是由于美拉德反應中會產生大量棕色含氮的共聚物和聚合物，即類黑素［26］，美拉德反應還會產生影響熱加工食品的風味色澤的中間產物和揮發性香氣物質等［27-28］，這些物質還具有一定的抗氧化性［29］。

表6 測定指標的相關系數Tab.6 Correlation coefficient of determination standard

2.3 正交試驗結果分析

為確定各因素的最佳參數，在單因素試驗基礎上，選定時間A、溫度B、黃原膠質量濃度C、pH值D四個因素的合適范圍進行正交試驗，具體水平如表3所示，正交試驗結果見表7。因本試驗的最優組合要求黃原膠溶液能對Suc-Asn體系中5-HMF形成起到抑制作用，因此應選擇最小K值作為每個因素的最優水平組合成最優組合（Ki表示任意列上水平號為i時所對應的試驗結果之和，R是每個因素下K的最大值減最小值）。

由表8可以看出，時間、溫度、濃度、pH值這四個因素的極差R值分別是24.01、50.68、19.19、27.70，所以這四個因素對Suc-Asn體系中5-HMF形成影響的主次順序是B＞D＞A＞C，即溫度＞pH值＞時間＞濃度。時間、溫度和濃度中K1最小，pH值中K3最小，因此只考慮抑制體系中5-HMF含量這一指標時，最優組合為A1B1C1D3，即當反應時間為12 min，反應溫度為160℃，添加0.1%黃原膠溶液及pH值為7時，黃原膠可對Suc-Asn體系中5-HMF的形成起到最佳的抑制作用。但是試驗組并沒有該組合，因此需要進行驗證性試驗。

表7 正交試驗因素水平表Tab.7 Factors and their levels in the orthogonal array design

表8 正交試驗結果Tab.8 Experimental design and corresponding results for orthogonal array analysis

2.4 驗證性試驗

通過檢測5-HMF含量，將分析最佳組合與試驗最佳組合得出的含量進行比較，試驗重復三次，試驗結果見表9。由表9可知，正交試驗分析得出的最優組合產生的5-HMF含量低于試驗最優組，因此分析結果成立，即試驗的最優組合為反應時間12 min，反應溫度160℃，0.1%黃原膠溶液，pH為7。

表9 驗證性試驗Tab.9 The replication experiment

3 討論

本試驗通過建立Suc-Asn反應體系模擬美拉德反應過程，探究反應時間、反應溫度、黃原膠質量濃度、體系pH值這四個因素對體系中5-HMF生成量、抗氧化能力和褐變度的影響。在單因素試驗中，不同反應時間、反應溫度、黃原膠質量濃度和體系pH值均對5-HMF生成量有顯著影響，抑制率從5.20%到80.00%不等。反應前期，反應時間較短，反應溫度較低時，蔗糖與天冬酰胺反應不完全，此時美拉德產物產出量相對較少，隨著反應的繼續進行，產物量得到積累，致使5-HMF生成量增加，體系抗氧化能力增強，褐變度增加。體系pH值既能影響羰氨縮合反應的程度，又能在高pH值時促使糠醛類物質重排成還原酮類產物，引起褐變。黃原膠獨特的膠凝作用可使得體系流動性降低，反應底物被包埋，從而抑制美拉德反應的進行。在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，得到最佳反應條件：反應時間為12 min，反應溫度為160℃，0.1%的黃原膠溶液，pH值為7。此時反應產生的5-HMF含量最低。

目前關于黃原膠抑制熱處理食品中5-HMF生成量的研究相對較少，多是研究黃原膠對美拉德反應丙烯酰胺生成量的影響或抗氧化劑對美拉德反應產物5-羥甲基糠醛生成量的影響。Shapla等［30］研究發現通過調節加工溫度可顯著減少5-HMF的形成。陳季旺課題組［10-12］研究發現在外裹糊中添加黃原膠可顯著增加美拉德反應產物丙烯酰胺的生成量，但本試驗研究發現黃原膠對5-HMF生成量有抑制作用，這可能是由于黃原膠可促進5-HMF進一步轉化成丙烯酰胺［14］，但其具體機理還需進一步證實。張振華［31］發現當pH為5.7時，5-HMF產量最低。Aykin等［32］研究發現在面制品中添加適量NaHCO3可有效抑制5-HMF的生成。張易楠［33］發現槲皮素和表兒茶素的羥基氫可與5-HMF及其前體的羥基發生分子間脫水反應，從而抑制5-HMF含量的產生。目前關于抑制5-HMF生成的研究相對較多，且其抑制方法繁多，黃原膠雖可減少5-HMF含量的生成，且與其他抑制方法存在一定的相似性，但其抑制機理仍有待進一步研究，此試驗旨在為5-HMF的控制提供更多依據。