低強度脈沖電磁場對大鼠跟腱異位骨化的影響

許世超 傅孫丹 李長明

異位骨化（heterotopic ossification，HO）是指軟組織出現成骨細胞并形成骨組織，大多發生在髖關節、肘關節等大關節周圍，常繼發于創傷、燒傷、神經損傷以及關節置換術后，是臨床嚴重并發癥[1]。臨床常用非甾體類消炎藥預防治療HO[2]，但長期服用可引起消化道毒性、腎臟毒性等副作用[3]。本研究觀察低強度脈沖電磁場（pulsed electromagnetic fields，PEMFs）對SD 大鼠HO 模型跟腱的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD 大鼠60 只，6～8 周齡，體質量（185.0±10.5）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[實驗動物合格證號：SCXK（滬）17-0005]，由浙江中醫藥大學實驗動物中心[SYXK（浙）2018-0012]飼養。飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及自由飲水，控制溫度（23±2）℃和濕度60%，12h 循環燈光。實驗操作均符合實驗動物倫理學要求（倫理審批號：IACUC-20190909-26）。

1.2 藥 物 水合氯醛（上海化學試劑采購供應五聯化工廠，規格：250g，批號302-17-0RT）；吲哚美辛（石藥集團河北永豐藥業有限公司，規格：25mg，批號20150703），取吲哚美辛膠囊50mg 粉末混于100mL生理鹽水，搖勻后制成0.5mg/mL 懸浮液。

1.3 主要試劑和儀器 Masson 三色染色液（北京利根生物技術有限公司，批號DC0032）；環氧合酶2（COX-2）Rb 抗 體（美 國Abcam 公 司，批 號Ab15191）；骨形態發生蛋白2（BMP-2）抗體（美國Abcam，批號Ab14933），辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（上海長島，批號D-3004）；DAB（上海長島，批號FL-6001）；蘇木精（珠海BASO 公司，批號714094）；RIPA 緩沖液（北京陽光生物科技有限公司，批號R0010）；BCA 試劑盒（Thermo 公司，批號PICPI23223）；聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜（美國，Millipore，批號HATF00010）；5%脫脂牛奶（美國BD Biosciences，批號BYL40422）；抗COX-2（美國Abcam，1：500，批號Ab15191），BMP-2（美國Abcam，1：500，批號Ab14933）；GAPDH[美國Cell Signaling Technology（CST），1：1000，批號＃5174]。山羊抗兔HRP 標記的二抗（北京ZSGB-BIO，1：1000；批號ZB-2301） 化學發光試劑（美國Millipore，批號WBKLS0100）；ECL 成像系統（Tanon，中國上海，型號Tanon-5200）；脈沖電磁場發生器（湖南省永逸科技有限公司，型號亥姆霍茲線圈）；小動物X 光機（日本Toshiba 公司，型號M262105）；正置顯微鏡（日本NIKON 公司，型號ECLIPSE Ni），IMS 圖像分析系統（日本NIKON 公司，型號DS-Ri2）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及造模 SD 大鼠60 只適應性飼養1周后按照隨機數字表法分為空白手術組、HO 模型組、PEMFs 干預組、吲哚美辛干預組四組，各15 只。造模方法：所有大鼠腹膜內注射10%水合氯醛（0.2～0.3mL/100g）麻醉后，手術部位進行皮膚準備及碘伏消毒，于右后肢后外側入路，暴露跟腱，空白手術組只暴露跟腱，不做其他處理，其余大鼠用血管鉗反復鉗夾跟腱5 次，其中跟腱中點處鉗夾1 次，中點上下各鉗夾兩次造成相當程度創傷。然后在跟鍵中點處將跟腱完全切斷，不予縫合。4 號絲線縫合皮膚，關閉切口。然后干預組給予干預處理。

2.2 干預方法 空白手術組和HO 模型組無需特殊處理。PEMFs 干預組：PEMFs 照射患肢，磁場強度2.5mT，頻率10Hz，脈沖時間間隔15s，每次20min，1天2 次。吲哚美辛干預組：按10mg·kg-1·d-1劑量每天灌胃吲哚美辛混懸液4mL。兩組療程均12 周，常規分籠飼養。

2.3 各組大鼠一般情況及影像學觀察 觀察各組大鼠一般情況、傷口愈合及雙后肢活動情況。術后4、12周所有大鼠經腹腔注射10%水合氯醛0.2～0.3mL/100g麻醉，釆用小動物X 光機，攝右后肢側位X 線片，觀察跟腱部位有無新骨形成。

2.4 跟腱標本取材以及組織學觀察 術后12 周，采用空氣栓塞法處死大鼠，切下完整的右跟腱組織以觀察跟腱形態。組織學觀察通過蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson 染色進行。

HE 染色：取切下的完整右跟腱組織包埋并固定后，將組織切成4μm 切片，然后在65℃的烤箱中烘烤30min。將切片浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中15min，依次浸入100%、95%、85%和75%的乙醇中5min，再用自來水沖洗10min。之后，將切片在蘇木精溶液中染色5min 后，在氨水中分色。流水沖洗15min，將切片依次在70%和90%的酒精中脫水10min，然后在1%曙紅溶液中染色2min，進行酒精脫水。圖片在顯微鏡上成像，使用IMS 圖像分析系統分析。

Masson 染色：將上述切片脫蠟，韋格鐵蘇木精染色10min。用酸性乙醇分化溶液分化后，用Masson 藍溶液將切片恢復為藍色。之后，將切片用蒸餾水洗滌1min，并用力春紅洋紅色染色溶液染色5min，用弱酸工作溶液洗滌1min（蒸餾水：弱酸溶液＝2：1），再用弱酸工作溶液洗滌2min。磷鉬酸溶液。此后，將切片用苯胺藍染色溶液染色2min，用弱酸工作溶液洗滌1min。將切片用無水乙醇脫水5s，3 次，二甲苯透明1min，3 次，用中性樹膠封固。圖片在顯微鏡上成像，使用IMS 圖像分析系統進行分析。

2.5 免疫組織化學（IHC）檢測 取切下的完整右跟腱組織包埋，固定并切成4μm 切片，在65℃的烤箱中烘烤30min。將切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脫蠟15min（上海國藥），依次在100%、95%、85%和75%的乙醇中浸泡5min，再用自來水沖洗10min，在室溫下于0.01mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中提取抗原15min 后，將切片在濕盒中與0.3%H2O2 孵育10min，與COX-2Rb 抗體、BMP-2 孵育1h，與HRP標記的二抗孵育30min。DAB 染色后，將切片用蘇木精染色3min，并用1%鹽酸進行酒精分化，然后用自來水沖洗10min。最后，將切片燒烤，透明和封閉，通過立式顯微鏡成像，使用IMS 圖像分析系統采用IHC 評分分析COX-2 和BMP-2 的表達。IHC 評分標準[4]：染色強度（無著色：0 分；淺黃色：1 分；棕黃色：2分；棕色：3 分）；陽性細胞百分比（0～5%：0 分；6%～25%：1 分；26%～50%：2 分；51%～75%：3 分；＞75%：4分）。上述兩個分數的乘積表示COX-2 或BMP-2 的表達。

2.6 蛋白質印跡（Western blot）分析 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液提取跟腱組織總蛋白。用BCA 試劑盒定量后，將25μg 的蛋白質進行10%SDS-PAGE 分離，并通過半干轉移將其轉移到PVDF 膜上。在室溫下，用5%脫脂牛奶封閉膜1h，4℃下 與 抗COX-2 （1：500）、BMP-2 （1：500）和GAPDH（1：1000）孵育過夜。TBST 洗滌6 次，將膜在山羊抗兔HRP 標記的二抗（1：1000）中于37℃孵育1h。用化學發光試劑顯影5min 后，將蛋白條帶暴露在ECL 成像系統上。相對于GAPDH，用1.47v 版本的ImageJ 軟件計算并分析COX-2 和BMP-2 的蛋白表達。

2.7 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（） 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況及影像學結果比較 各組大鼠術后切口愈合良好，術后右后肢活動減少，術后2周恢復正常。術后4、12 周，空白手術組大鼠均未見骨化，HO 模型組第4 周少量高密度影出現，提示異位骨的形成。術后12 周，HO 模型組大鼠骨化比第4周時更加成熟，骨化區域更大，亮度更高。PEMFs 干預組術后第4 周未見明顯異位骨化，術后12 周與HO 模型組、吲哚美辛干預組相比骨化面積最小，X線表現密度影最低。吲哚美辛干預組術后4 周未見明顯HO，術后12 周骨化面積、亮度均低于HO 模型組大鼠。結果表明血管鉗反復鉗夾跟腱的方法可以成功構建大鼠跟腱HO 模型，而干預組的干預措施可以減弱HO 的發生。見插頁圖1。

圖1 各組大鼠后肢外側X 線表現

圖2 術后12 周各組大鼠跟腱組織學觀察[圖A（HE 200×） 圖B（Masson 200×）]

3.2 各組大鼠手術跟腱組織學觀察結果 術后12周，HE 染色發現HO 模型組跟腱結構被破壞，大量炎性細胞增殖并出現軟骨細胞，而PEMFs 干預組和吲哚美辛干預組跟腱細胞肌腱排列整齊，無軟骨細胞和骨組織（見圖插頁2A）。認為PEMFs 干預組和吲哚美辛干預組的干預措施顯著抑制了炎性細胞的增殖和軟骨細胞的形成。Masson 染色發現HO 模型組跟腱結構被破壞，Ⅰ型膠原在骨形成區域的軟骨細胞周圍增殖形成大量骨結構。而PEMFs 干預組和吲哚美辛干預組出現少量骨結構（見插頁圖2B）。認為PEMFs 干預組和吲哚美辛干預組的干預措施對Ⅰ型膠原的增殖具有明顯的抑制作用。

3.3 各組大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 蛋白表達比較術后12 周，IHC、Western blot 檢測結果顯示，HO模型組跟腱COX-2、BMP-2 表達高于空白手術組（P＜0.01）。PEMFs 干預組、吲哚美辛干預組COX-2、BMP-2 表達低于HO 模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。上述結果表明，PEMFs 干預組、吲哚美辛干預組干預措施可降低HO 模型大鼠跟腱COX-2 或BMP-2 的表達。見表1、圖3。

表1 各組大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 陽性表達比較（分，）

表1 各組大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 陽性表達比較（分，）

注：空白手術組只暴露跟腱，不予鉗夾跟腱；HO 模型組予鉗夾跟腱；PEMFs 干預組予鉗夾跟腱，PEMFs 照射患肢；吲哚美辛干預組予鉗夾跟腱，灌胃吲哚美辛；PEMFs 為低強度脈沖電磁場；與空白手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

圖3 各組大鼠跟腱Western blot 檢測結果比較

4 討論

通過血管鉗反復鉗夾跟腱的方法建立HO 模型是一種簡單、快捷、成模率高、病理表現與人HO 產生相似的方法[5-6]。本研究顯示，通過血管鉗反復鉗夾跟腱，HO 模型組大鼠術后4 周出現HO，12 周骨化面積顯著增大；大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 含量增多，考慮反復鉗夾跟腱破壞了軟組織的微環境，大量的炎性細胞增殖并出現軟骨細胞，通過軟骨化骨的方式形成HO[7]。可誘導的成骨前體細胞、刺激因子和誘導軟組織骨化的局部微環境是HO 形成的三個基本條件[8-9]。目前臨床應用最廣泛且對預防HO 效果較為肯定的非甾體類藥物主要是吲哚美辛，但用藥的最佳時間、劑量及持續時間尚不明確[10-12]。并且應用吲哚美辛存在胃腸道不良反應、消化道出血以及骨不連的風險[13]。

PEMFs 可以增加疼痛和炎癥區域的血流，改善局部血液循環及營養狀態，促進滲出物的吸收與消散，產生消除腫脹、緩解或消除疼痛的作用，還能抑制炎癥介質的致炎作用，增加通透性，促進水腫吸收，降低神經末梢反應性，對中樞神經有鎮痛作用[14]。本研究顯示，術后12 周，PEMFs 干預和吲哚美辛干預均顯著抑制炎性細胞、Ⅰ型膠原的增殖和軟骨細胞的形成。IHC、Western blot 結果顯示，PEMFs 干預組、吲哚美辛干預組跟腱COX-2、BMP-2 表達低于HO 模型組。COX-2 主要參與病理條件下前列腺素（prostaglandin，PG）調控，并具有可持續轉錄和穩定表達的特征，在外部刺激下，COX-2 表達上調，誘導PG 合成，促進成骨細胞活性和骨形成[15]。細胞因子骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具有顯著的誘導成骨能力，可能通過刺激間充質干細胞、成骨細胞的增殖與分化，和（或）通過刺激細胞外基質的合成與礦化等一系列過程來促進骨形成[16]。Lin 等[17]發現，HO 形成期間BMP-2、BMP-4 和BMP-7 顯著升高。本研究顯示，PEMFs 和吲哚美辛對HO的抑制作用無明顯差異，可能通過阻斷COX-2 和BMP-2 介導的信號傳導通路，從而抑制HO 的產生。