西洛他唑促進小鼠急性腦梗死區域血管內皮增殖相關研究

盧 山 錢 蕓 夏文卿 汪 容 唐 波

西洛他唑（cilostazol，CLZ）是一種磷酸二酯酶Ⅲ抑制劑，用于腦梗死后的抗血小板聚集治療。前期研究報道發現，在小鼠腦梗死急性期給予CLZ 治療，可改善小鼠腦梗死區域的腦血流量，并促進小鼠大腦由來血管內皮細胞的內皮型一氧化氮合酶的活化[1]。本研究通過測定腦梗死模型小鼠CLZ 治療后腦梗死區域的血小板-內皮細胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）陽性標記細胞數量，以及通過測定加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）培養的小鼠大腦由來血管內皮細胞BrdU 陽性標記血管內皮細胞數，從而明確CLZ 是否具備促進小鼠血管內皮細胞增生的能力。現將報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 級8 周齡雄性Icr 小鼠12 只，體質量18.0～23.0（20.0±3.0）g，由浙江中醫藥大學動物試驗中心提供（實驗動物合格證號：上海西普爾必凱實驗動物有限公司，SCXK（滬）2018-0006），置于浙江中醫藥大學動物房12h 明暗周期循環，控制室溫為（21±2）℃。制備腦梗死模型后1 周內予以粉狀飼料飼養。本實驗取得浙江中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，動物倫理審批編號：20191216-22。

1.2 細胞株 CRL-2299 系列小鼠大腦由來血管內皮細胞，由美國ATCC 公司提供。

1.3 試 劑 CD31 抗體（批號sc-376764，規格：200μg/mL，公司：Sante Cruz）；山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor 488（批號ab150113，規格：500μg，公司：ABCAM）；Brdu 抗體（批號B2531，規格：100μL，公司：sigma）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 555）（批號ab150078，規格：500μg，公司：ABCAM）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（批號28718-90-3，規格：10mg，公司：kirkegaard&Perry）。

1.4 藥 物 CLZ（批號190106P，規格：50mg/粒），由浙江大冢制藥有限公司提供。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 為保證腹腔注射給藥劑量的穩定性，將CLZ 粉碎后用羥乙基-β-環糊精（2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HPβCD）制備成性質較穩定濃度為5%的CLZ 懸濁液。

2.2 小鼠腦梗死模型建立 12 只小鼠均使用3%異氟烷誘導全身麻醉及1.5%異氟烷維持麻醉，以右側臥位固定，暴露左側顳部，消毒后于左耳外耳道至左眼連線中點處剪開皮膚，鈍性分離靜脈、唾液腺及肌肉，并電凝阻斷手術視野內所見血管。分離相關組織至左側顴骨顴弓區，剪斷顴骨，繼續分離肌肉及相關組織至顱底，在嗅索區域使用骨鉆去除顱骨，分離已暴露的硬腦膜，充分暴露左側大腦中動脈，在近嗅索區使用雙極電凝器阻斷左側大腦中動脈，并用顯微剪剪斷已電凝阻斷部位的殘余血管以確保血管阻斷。于手術區域加入動物用抗生素，將之前鈍性分離的組織復位，縫合皮膚。術后將小鼠放入恒溫箱內觀察，待完全脫離麻醉狀態后繼續相關實驗。手術過程中將小鼠體溫控制于（37.0±0.2）℃。建模成功后，小鼠左側大腦即出現局限于大腦皮層的腦梗死病灶。

2.3 分組及給藥 將完成建模手術后的小鼠分為CLZ 組和HPβCD 組，每組6 只，分別予以50μL CLZ懸濁液及50μL HPβCD 溶液進行腹腔注射（1 次/日）。注射開始7 天后，使用異氟烷進行深度麻醉并使用4%甲醛對建模小鼠進行循環灌注，然后按16mm 厚度進行大腦冰凍切片制作，并對切片進行CD31 免疫熒光標記，并使用Alexa-conjugated（Alexa Fluor 488 or 555）進行顯色標記。使用4，6-二氨基－2－苯基吲哚（4'，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）進行細胞核標記。制作完成的小鼠大腦切片使用共聚焦鐳射顯微鏡進行觀察拍攝，并使用ImageJ 的彩色無序圖像外輪廓提取方法對所得到圖像進行腦梗死區域及缺血半暗帶區域進行CD31 陽性標記細胞密度測定及分析。

2.4 細胞培養 在24 孔培養皿中使用血管內皮培養液培養小鼠大腦由來血管內皮細胞（細胞濃度：1×104cells/well）。培養1 天后，分別換用加入含有4μg 5%濃度CLZ 懸濁液的血管內皮培養液（共500μL）繼續培養。對照組使用分別添加4μg 的HPβCD 血管內皮培養液。在培養開始第4 天時，往各組培養皿中加入BrdU（10μg/mL）。于第5 天時固定細胞，并使用BrdU 顯色抗體進行顯色染色，每個培養皿相同區域于顯微鏡下觀察并統計細胞總數以及BrdU 陽性標記細胞數。

2.5 統計學方法 應用SPSS 23.0 統計軟件處理數據，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（） 表示，比較采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 兩組小鼠大腦冰凍切片CD31 染色標記圖像及圖像數據分析 通過使用ImageJ 彩色無序圖像外輪廓提取方法，提取出A-D 中CD31 陽性標記（紅色標記）區塊面積和各切片病理組織區塊總面積（簡稱為總面積）。（見插頁圖1）CLZ 組CD31 陽性標記區域面積占總面積比例（0.101±0.027）較HPβCD（0.049±0.013）組明顯增多，差異均有統計學意義（P 均＜0.05）。

3.2 小鼠大腦由來血管內皮細胞增殖數相關分析加入含CLZ（10μg/L）的血管培養液培養的小鼠大腦由來血管周細胞在經過5 天培養后，BrdU 陽性標記細胞數占DAPI 標記細胞核數比值較HPβCD 組高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1，插頁圖2。

圖1 兩組小鼠大腦冰凍切片CD31 染色標記圖像及相關圖像

圖2 兩組小鼠大腦由來血管內皮細胞總數及BrdU 陽性標記細胞數占細胞總數相關分析

表1 CLZ 促進小鼠大腦由來血管周細胞增殖效果影響（個/高倍鏡，）

表1 CLZ 促進小鼠大腦由來血管周細胞增殖效果影響（個/高倍鏡，）

注：CLZ 組給予以50μLCLZ 懸濁液腹腔注射；HPβCD 組給予50μL HPβCD 溶液腹腔注射；與HPβCD 組比較，aP＜0.05

4 討論

CLZ 已在臨床用于腦梗死二級預防[2]。通過已經完成的本項目相關前期研究發現，CLZ 可明顯增加小鼠腦梗死急性期腦梗死區域的腦血流量[1]，以及CLZ 可促進小鼠大腦由來血管內皮細胞的內皮型一氧化氮合成酶的活性成分生成[3]，這與本項目組既往相關研究報道CLZ 可改善機體組織缺血區域血流量[4-5]，減少缺血后的組織損傷結論相符[6-7]。

結合本項目前期相關研究結果，通過本項目此次研究發現，經過CLZ 治療的急性腦梗死建模小鼠梗死區域的CD31 陽性標記細胞所占面積較PBS 及HPβCD 組有明顯增多，因此筆者認為CLZ 具備促進小鼠腦急性梗死區域血管內皮細胞增殖的能力。在進一步的離體細胞培養實驗中我們發現，使用CLZ（10μ/L）組的BrdU 陽性標記細胞數與DAPI 陽性標記細胞數比值與PBS 組及HPβCD 組亦有明顯差異，說明CLZ 可通過促進血管內皮細胞增殖，達到促進小鼠腦梗死后腦梗死區域的新生血管增殖的效果，相關研究結果與已有其他相關報道CLZ 可能通過上調血管緊張素Ⅱ及血管內皮生長因子等途徑促血管生成因子的表達進而促進缺血區域血管新生的結論相符[8-10]，也可進一步解釋為CLZ 有改善血管相關細胞功能的能力[11-12]，具備促進微血管新生[13-15]、改善腦缺血區域血流量的作用[16]。

綜上所述，CLZ 在腦梗死急性期具備促進血管內皮增殖的能力進而達到促進小鼠腦梗死后腦梗死區域血管新生效果，進而起到改善腦梗死區域腦血流量效果,為腦梗死后缺血區域受損組織修復提供必要條件。