SH2B3 基因單核苷酸多態性與自身免疫性肝病相關性分析

湯斌斌 余 光 王宏剛 莫霏霏 王國祥

自身免疫性肝病是一組病因不明，與自身免疫異常有關的肝組織損傷、肝功能異常疾病[1]。根據其臨床表現、免疫學、生化、組織病理學特點，主要分為自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、原發性硬化性膽管炎等，其中較常見的兩種自身免疫性肝病為PBC 和AIH[2]。自身免疫性肝病無特異性臨床病癥，確診時間晚，危害嚴重，目前缺乏明確的診斷標準[3]。SH2B 銜接蛋白3（SH2B3）屬于SH2B 銜接蛋白家族中的成員，是一種細胞內銜接蛋白，在多種信號轉導途徑中作為負調節物而發揮作用，包括炎癥信號通路[4-5]。Zhou 等[6]研究表明，人類染色體12q24 位點以SH2B3 和ATXN2 基因為核心，與1 型糖尿病、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡、多發性硬化等自身免疫疾病有關。本研究通過對SH2B3 基因中Rs3184504 的單核苷酸多態性進行探究，進而探討SH2B3 基因單核苷酸多態性與自身免疫性肝病的關聯性，以期為自身免疫性肝病患者提供潛在的基因診斷標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013 年7 月—2020 年1 月于浙江省臺州市立醫院就診的自身免疫性肝病患者162 例為研究對象，其中PBC 患者84 例（PBC 組），年齡34～67 歲；AIH 患者78 例（AIH 組），年齡33～68歲；同期選取健康體檢者72 名為對照組，年齡33～67歲。本實驗經醫院倫理委員會審核通過，符合《赫爾辛基宣言》倫理原則；所有受試對象均由專業人員詳細告知研究內容并自愿參加，同時簽署知情同意書。

1.2 納入標準 （1）PBC 和AIH 診斷參照《自身免疫性肝病診斷和治療指南》[7]中的相關標準；（2）不伴有肝癌或其他惡性腫瘤者；（3）臨床資料保存完整者；（4）研究對象均為漢族人群，年齡≥18 歲，性別不限。

1.3 排除標準 （1）伴有嚴重心血管疾病、腎臟疾病等嚴重疾病者；（2）伴有急慢性感染性疾病及各種免疫系統疾病者；（3）妊娠期或哺乳期婦女。

1.4 主要試劑與儀器 血液基因組DNA 提取試劑盒（批號DK604）購自上海萊楓生物科技有限公司；PCR buffer Set（PCR buffer 及MgCl2 稀釋液，批號11160010-1）購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司；白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號SEKH-0020）購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）ELISA 試劑盒（批號orb405970）購自武漢博歐特生物科技有限公司。PUZS-300 型自動生化分析儀購自上海帝博思生物科技有限公司

1.5 研究方法

1.5.1 血清學指標測定 抽取三組受試者清晨空腹外周靜脈血樣，置于-80℃保存。ELISA 法檢測血清IL-12、IL-17 表達水平；常規自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶（alanineaminotrarsferase，ALT）和γ-谷氨酰轉肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT）水平。操作步驟嚴格按照試劑盒及儀器使用說明書進行。

1.5.2 SH2B3 基因單核苷酸多態性檢測 參照試劑盒說明書提取外周血DNA，核酸定量儀測定A260/A280，計算DNA 純度和濃度，并將濃度稀釋到50ng/μL，-20℃保存。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 引物序列（見表1）。反應體系共25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl21.5μL，上下游引物各0.5μL，dNTP 2.0μL，模 板DNA 2.0μL，Taq DNA polymerase 0.2μL，ddH2O 15.8μL。反應條件：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，40 個循環。瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠成像儀分析，將單一明亮條帶的PCR 產物送上海生工生物工程有限公司純化并測序，BLAST 進行測序結果比對。

1.6 統計學方法 應用SPSS 23.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行t 檢驗；計數資料以[例/百分比（%）]表示，行χ2檢驗；Logistic 回歸分析影響PBC、AIH 發生的因素。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 三組研究對象年齡、性別、病程、體質指數（BMI）、吸煙比例、飲酒比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 結果顯示，SH2B3 在rs3184504 的多態位點上有三種基因型，分別為CC 型、CT 型、TT 型。對照組基因型中CC 型最多，其次為CT 型，TT 型最少；PBC 組基因型中CT 型最多，其次為CC 型，TT 型最少；AIH 組基因型中CC型最多，其次為CT 型，TT 型最少；PBC 組、AIH 組中CT、TT 兩種基因型占比明顯較對照組升高（P＜0.05）。根據Hardy-Weinberg 平衡定律，對照組、PBC組及AIH 組各基因型的期望值和觀測值符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P 均＞0.05），提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性。見表3。

2.3 PBC、AIH 患者各基因型血清學指標比較 PBC、AIH 患者各基因型ALT、GGT、IL-12、IL-17 水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

2.4 影響PBC、AIH 發生的多因素分析 將PBC、AIH 是否發生作為因變量，校正年齡、性別、BMI、吸煙比例、飲酒比例、ALT、GGT、IL-12、IL-17 等混雜因素后，以SH2B3 三種基因型（CC 型、CT 型、TT 型）為自變量進行Logistic 回歸分析，結果顯示CT 型、TT型基因型是影響PBC 發生的獨立危險因素（P＜0.05），TT 型基因型是影響AIH 發生的獨立危險因素（P＜0.05）。見表5-6。

3 討論

目前較為常見的自身免疫性肝病為PBC 和AIH[8]，PBC 是一種非化膿性、慢性膽管炎，血清生化異常以ALT 和GGT 升高最為常見[9-10]。AIH 無特異性臨床癥狀和體征，AIH 常見的生化異常是血清ALT 和天冬氨酸氨基轉移酶水平升高[11-12]。研究表明，基因多態性與自身免疫性肝病易感性相關[13]。

SH2B3 基因是銜接蛋白SH2B 家族的一個成員，參與多種信號事件的整合和調控[14]。SH2B3 參與細胞因子信號傳導途徑，是T 細胞受體信號傳導的負性介質[15]。SH2B3 在內皮細胞中作為負調節因子抑制腫瘤壞死因子信號，進而降低促炎性反應，SH2B3 在動脈粥樣硬化和血壓調節等過程中也發揮重要作用[16-17]。Umemura 等[18]對158 例AIH 患者的SH2B3 基因型進行分析探究，證明SH2B3 中的rs3184504 的錯義突變與AIH 有關。本研究中對照組基因型中CC 型（占84.72%）最多，其次為CT 型（占13.89%），TT 型（占1.39%）最少；PBC 組基因型中CT型（占46.43%）最多，其次為CC 型（占41.67%），TT型（占11.90%）最少；AIH 組基因型中CC 型（占50.00%）最多，其次為CT 型（占35.90%），TT 型（占14.10%）最少，PBC 組、AIH 組中CT、TT 兩種基因型占比明顯較對照組升高（P＜0.05）。提示CT、TT 基因型攜帶者比CC 基因型攜帶者的患病風險可能更高，分析Rs3184504 位點T 等位基因可能是自身免疫性肝病易感基因。唐瑩瑩[19]研究表明，除血清ALT 和GGT 外，IL-17 也參與了自身免疫性肝病的發生、發展，可引起肝臟免疫炎癥反應。本研究中各基因型患者ALT、GGT、IL-12、IL-17 表達水平差異均有統計學意義（P＜0.05）。認為PBC 組、AIH 組患者體內SH2B3 基因型表達異常可能影響患者體內免疫調節機制，即T 細胞與Th17 細胞之間的平衡，而由Th17細胞分泌產生的IL-17 等炎癥因子表達水平的異常，可能成為自身免疫性肝病發生的主要免疫因素。Logistic 回歸分析結果顯示，CT 型、TT 型基因型是影響PBC 發生的獨立危險因素（P＜0.05），TT 型基因型是影響AIH 發生的獨立危險因素（P＜0.05）。提示攜帶CT 型發生PBC 可能性較高，攜帶TT 型發生PBC、AIH 可能性均較高，攜帶SH2B3 基因rs3184504 T 等位基因者更容易罹患自身免疫性肝病。

表1 qRT-PCR 引物序列

表2 三組研究對象一般資料比較

表3 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗結果[例（%）]

表4 PBC、AIH 患者各基因型血清學指標比較（）

表4 PBC、AIH 患者各基因型血清學指標比較（）

注：PBC 組為原發性膽汁性肝硬化患者；AIH 組為自身免疫性肝炎患者；ALT 為丙氨酸氨基轉移酶；GGT 為γ-谷氨酰轉肽酶；IL-12 為白細胞介素-12；IL-17 為白細胞介素-17；與CC 組比較，aP＜0.05；與CT 組比較，bP＜0.05

表5 影響PBC 發生的多因素分析

表6 影響AIH 發生的多因素分析

綜上所述，SH2B3 單核苷酸多態性與自身免疫性肝病有一定相關性，其中CT 型、TT 型基因型可能與PBC 發生有關，TT 型基因型可能與AIH 發生有關，臨床上可通過檢測SH2B3 基因型，對自身免疫性肝病做出初步預測，以便盡早干預和控制，對預防自身免疫性肝病的發生可能具有重要價值，同時為臨床治療PBC、AIH 開辟新思路和視野，但具體作用機制仍需進一步研究。