嗜酸乳桿菌發酵豬肉干貨架期延長的條件優選

陳菲菲，趙長青，王世超，馮嬌

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000)

鑒于當代人越來越強的保健意識，發酵類食品因其豐富的營養價值而受到關注。發酵肉制品中富含的有益微生物可產生乳酸、乳酸菌素等代謝產物，降低了肉制品的pH，對致病菌和腐敗菌形成競爭性抑制作用[1]；在發酵的同時還會降低肉品水分含量，這些能夠提高肉制品安全性并延長其貨架期。豬肉作為最通用的食材，其蛋白質含量高，而脂肪、膽固醇含量相對較低，味道鮮美而且營養價值豐富[2]，因而將豬肉進行發酵制成休閑食品是一大趨勢。比如將豬肉制成發酵香腸已有許多研究[3-6]，而火腿也是豬肉比較常見的一種加工方式，現也有相關報道[7-9]，對火腿中菌群進行了分析和篩選，現在比較受歡迎的豬肉脯也可見相關研究[10]。在西方國家如美國、德國、意大利等已經有較成熟的發酵肉制品的人工發酵生產技術并且已經實現了工業化生產[11]，研究發現攝入乳酸桿菌和含活性乳酸菌的食品會使乳酸菌定植到人的大腸內，繼續發揮作用，從而形成抑制有害菌增殖的環境，有利于協調人體腸道內微生物菌群的平衡[12]。

傳統工藝生產的豬肉干多會添加發色劑硝酸鹽、亞硝酸鹽和防腐劑等，雖然市場上產品按照國家標準進行添加，攝入量較小，但畢竟存在安全隱患[13]。而發酵豬肉干因具有特有的風味、便捷、營養、不添加任何防腐劑、開發潛力巨大等優勢，逐漸受到越來越多消費者的青睞和歡迎。如今利用乳酸菌作為功能性發酵劑，將豬肉發酵制成發酵豬肉干的嘗試也逐漸成為一種新的休閑肉制品加工方法。目前研究延長發酵肉制品的貨架期方面已有報道[14,15]。本實驗在前期對發酵豬肉干風味等方面已經進行過相關研究[16]，為了將發酵豬肉干向工業生產方向發展，還需要對發酵豬肉干的貨架期進行進一步研究。

本實驗通過探索不同的發酵條件(接種量、發酵溫度、發酵時間)和烘烤條件(烘烤溫度、烘烤時間)，研究如何延長嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的貨架期，以微生物指標為標準，確定出貨架期最長的發酵豬肉干工藝條件，為發酵肉制品的生產和微生物控制提供了參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

新鮮豬肉、白砂糖、鹽、菜籽油、醬油、姜、高溫蒸煮袋:市售；葡萄糖、乳糖：分析純，成都市科龍化工試劑廠；牛肉浸膏、蛋白胨、氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 菌株

實驗用嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)為本實驗室儲藏，使用前在乳酸菌培養基上活化24 h。

1.1.3 儀器與設備

HH-6D數顯恒溫水浴鍋、SHP-80生化培養箱 常州普天儀器制造有限公司；JA5003電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰空氣技術有限公司；V1000型可見分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司；DHG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱 上海瑯玕實驗設備有限公司；PHS-3C數字酸度計 成都方舟科技開發有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩培養箱 上海蘇坤實業有限公司；DZQ4/2E真空包裝機 溫州奔騰機械有限公司。

1.2 實驗

1.2.1 發酵豬肉干加工工藝流程

發酵液的制備→原料肉預處理→初煮→復煮→滅菌→接種→發酵→烘烤→包裝→滅菌→儲藏。

1.2.2 單因素實驗

通過對發酵條件和烘烤條件進行優化，目的是探索出貨架期較長的發酵豬肉干的工藝條件。本實驗以前期研究得到的感官指標較好的發酵豬肉干作為對照組，其工藝條件為：接種量5%、發酵時間36 h、發酵溫度30 ℃、烘烤溫度95 ℃、烘烤時間75 min。本實驗中發酵條件(接種量、發酵溫度、發酵時間)和烘烤條件(烘烤時間、烘烤溫度)的優化步驟如下。

1.2.2.1 接種量的優化

在發酵時間36 h、發酵溫度30 ℃、烘烤溫度95 ℃、烘烤時間75 min的情況下，分別取接種量1%、2.5%、5%、7.5%、10%(V/V)，以考察接種量對發酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.2 發酵溫度的優化

在接種量5%、發酵時間36 h、烘烤溫度95 ℃、烘烤時間75 min的情況下，分別取發酵溫度20，25，30，35，40 ℃，以考察發酵溫度對發酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.3 發酵時間的優化

在接種量5%、發酵溫度30 ℃、烘烤溫度95 ℃、烘烤時間75 min的情況下，分別取發酵時間12，24，36，48，60 h，以考察發酵時間對發酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.4 烘烤時間的優化

在接種量5%、發酵溫度30 ℃、發酵時間36 h、烘烤溫度95 ℃的情況下，分別取烘烤時間為70，75，80，85 min，以考察烘烤時間對發酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.5 烘烤溫度的優化

a.不同溫度下含水率小于且最接近20%的烘烤時間的測定

按照國家標準，肉干類制品含水率不得超過20%[17]。為了既能達到國家要求，又能使豬肉干具有較好口感，實驗需首先測得不同溫度(75，85，95，105 ℃)下發酵豬肉干含水率小于且最接近20%的烘烤時間。

b.最優烘烤溫度的確定

在接種量5%、發酵溫度30 ℃、發酵時間36 h的情況下，改變烘烤溫度(各烘烤溫度下對應的烘烤時間為豬肉干含水率小于且最接近20%的烘烤時間)，取值分別為75，85，95，105 ℃，以考察烘烤溫度對發酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.3 發酵豬肉干微生物指標檢測

按照肉干的國家標準，通過檢測嗜酸乳桿菌發酵豬肉干中微生物指標(包括菌落總數、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌)來確定其貨架期，檢測標準見表1。即：本次實驗對發酵豬肉干的微生物檢測采取三級采樣方案，按照三級采樣方案設定的指標，在同一批發酵豬肉干的5個樣品中，允許全部樣品中菌落總數≤104CFU/g、大腸桿菌數≤10 CFU/g；允許有≤2個樣品的菌落總數在104～105CFU/g之間、大腸桿菌數在10～102CFU/g之間，不允許有樣品的菌落總數>105CFU/g、大腸桿菌數>102CFU/g；任何一個樣品不得檢出致病菌(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌)[18]。

其中，菌落總數的檢測參照GB 4789.2-2016操作；大腸菌群的檢測參照GB 4789.3-2016操作；沙門氏菌的檢測參照GB 4789.4-2016操作；金黃色葡萄球菌的檢測參照GB 4789.10-2016操作；志賀氏菌的檢測參照GB 4789.5-2012操作。

表1 發酵豬肉干微生物指標[19]

2 結果與分析

2.1 不同發酵條件對發酵豬肉干貨架期的影響

2.1.1 接種量對發酵豬肉干貨架期的影響

表2 不同接種量下豬肉干的微生物檢測結果

由表2可知，當發酵豬肉干儲藏溫度為30 ℃時，未發酵的豬肉干在儲藏3 d時長出了致病菌沙門氏菌,在儲藏2 d時微生物指標符合國家標準，所以未發酵豬肉干的貨架期為2 d；接種量為5%的未優化發酵豬肉干在儲藏7 d時長出了致病菌金黃色葡萄球菌；接種量為2.5%和7.5%的發酵豬肉干在儲藏7 d時長出了致病菌金黃色葡萄球菌；接種量為10%的豬肉干在儲藏13 d時最高的微生物菌落總數為1.35×105CFU/g，超過了微生物上限值105CFU/g，而且長出了致病菌金黃色葡萄球菌，以上均不符合儲藏要求，被淘汰。接種量為1%的發酵豬肉干在儲藏16 d時長出了金黃色葡萄球菌，在儲藏13 d時微生物指標符合國家標準，所以未發酵豬肉干的貨架期為13 d，是接種量優化實驗中貨架期最長的。因此，可以確定1%為嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的最優接種量。相比較未發酵的豬肉干(2 d)，其貨架期延長了11 d，主要是因為在此接種量下可以促進嗜酸乳桿菌新陳代謝，將糖類或糖類物質分解產生有機酸、乙醇等物質，進而抑制有害微生物(脂解菌和朊解菌等)的生長繁殖活動[20]，從而使有害菌的生長不能大量進行，所以延長了發酵豬肉干的儲藏時間。

2.1.2 發酵時間對發酵豬肉干貨架期的影響

表3 不同發酵時間下豬肉干的微生物檢測結果

由表3可知，發酵時間為12，24，36 h的發酵豬肉干在7 d時都長出了致病菌金黃色葡萄球菌，按照國家標準這些樣品被淘汰。儲藏到第10天時，發酵時間為48 h的發酵豬肉干長了致病菌沙門氏菌，說明該樣品已經過期；儲藏到第13天時，發酵時間為60 h的豬肉干長了致病菌金黃色葡萄球菌，被淘汰，說明其貨架期為10 d，較未發酵豬肉干貨架期(2 d)延長了8 d，是發酵時間優化實驗中貨架期最長的。因此，確定60 h為嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的最優發酵時間，主要原因可能是在豬肉進行發酵的過程中，隨著發酵時間的延長，嗜酸乳桿菌跨過生長和繁殖階段，進行同型乳酸發酵，同時產生谷氨酸和甘氨酸等風味物質，發酵過程中酸類物質積累，腐敗菌生理活動得到基本抑制，所以其貨架期有所延長。

2.1.3 發酵溫度對發酵豬肉干貨架期的影響

表4 不同發酵溫度下豬肉干的微生物檢測結果

由表4可知，將發酵豬肉干儲藏7 d后，發酵溫度為20，25，30 ℃的發酵豬肉干都檢測出了致病菌金黃色葡萄球菌，因此被淘汰。發酵溫度為35 ℃的發酵豬肉干在儲藏7 d時大腸菌群為3.1×103CFU/g，超過了大腸桿菌上限值102CFU/g，超標，被淘汰。發酵溫度為40 ℃的發酵豬肉干在儲藏10 d時，有3個樣品菌落總數在104～105CFU/g之間，說明在該發酵時間下的豬肉干貨架期為7 d，是發酵溫度優化實驗中貨架期最長的。因此，確定40 ℃為嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的最優發酵溫度。相比于未發酵的豬肉干(2 d)，貨架期延長了5 d，原因可能是在此發酵溫度下，促進了嗜酸乳桿菌對營養物質的吸收，提高了微生物體內酶促反應的速度[21]，蛋白質和脂肪等在組織蛋白酶和脂肪酶的作用下分解為各種有機酸(游離氨基酸和乳酸等)，使整個發酵豬肉干呈現酸性環境，腐敗細菌得到基本抑制，所以發酵豬肉干的貨架期有所延長。

2.1.4 烘烤時間對發酵豬肉干貨架期的影響

表5 不同烘烤時間下豬肉干的微生物檢測結果

由表5可知，儲藏到第7天時，烘烤時間為70 min和75 min的發酵豬肉干都檢測出了致病菌金黃色葡萄球菌；烘烤時間為85 min的發酵豬肉干在儲藏7 d時微生物菌落總數最高，為1.76×105CFU/g，超過了菌落總數上限值105CFU/g，以上均不符合國家標準，被淘汰。烘烤時間為80 min的發酵豬肉干在儲藏13 d時微生物菌落總數最高，為1.25×105CFU/g，超過了菌落總數上限值105CFU/g，而且長出了致病菌金黃色葡萄球菌，說明該烘烤時間下的豬肉干貨架期為10 d，是烘烤時間優化實驗中貨架期最長的。因此，確定80 min(烘烤溫度為95 ℃)為嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的最優烘烤時間，相比于未發酵的豬肉干(2 d)，貨架期延長了8 d。烘烤時間為80 min的豬肉干貨架期有所延長，原因可能是隨著烘烤時間的延長，肉干的水分活度(Aw)有所下降，當Aw低于0.9時，細菌幾乎不能生長，Aw的減少降低了微生物生長速率，延長了微生物對數生長期，此外還對微生物的代謝活動產生負作用，引起了代謝途徑和細胞成分的變化[22]，所以延長了發酵豬肉干的貨架期。

2.2 烘烤溫度對各指標的影響

2.2.1 含水率的測定

為了對嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的烘烤溫度進行優化，需要找到不同烘烤溫度下含水率小于且最接近20%(按照國家標準，肉干含水率不超過20%)的烘烤時間，這樣既能達到國家要求，又能使豬肉干具有較好口感，不同烘烤條件的發酵豬肉干含水率見圖1。

圖1 不同烘烤條件下發酵豬肉干的含水率

由圖1可知，當烘烤溫度為75 ℃時，含水率小于且最接近20%(按照國家標準，肉干含水率不超過20%)的烘烤時間為125 min，此時含水率為18.86%。當烘烤溫度為85 ℃時，含水率小于且最接近20%的烘烤時間為100 min，此時含水率為19.35%。當烘烤溫度為95 ℃時，含水率小于且最接近20%的烘烤時間為75 min，此時含水率為18.20%。當烘烤溫度為105 ℃時，含水率小于且最接近20%的烘烤時間為65 min，此時含水率為19.78%。

2.2.2 烘烤溫度對發酵豬肉干貨架期的影響

表6 不同烘烤溫度下豬肉干的微生物檢測結果

由表6可知，儲藏7 d時，烘烤溫度為75，95 ℃的發酵豬肉干都長出了致病菌金黃色葡萄球菌；烘烤溫度為85 ℃的發酵豬肉干在儲藏10 d時5個樣品的菌落總數在104～105CFU/g之間，以上均不符合國家標準，被淘汰。烘烤溫度為105 ℃的發酵豬肉干在儲藏13 d時微生物菌落總數最高，為2.53×105CFU/g，超過了菌落總數上限值105CFU/g，說明該烘烤溫度下的豬肉干貨架期為10 d，是烘烤溫度優化實驗中貨架期最長的。因此，確定105 ℃(烘烤時間為65 min)為嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的最優烘烤溫度。相較于未發酵的豬肉干(2 d)，發酵豬肉干貨架期延長了8 d，主要原因是該烘烤溫度下制成的發酵豬肉干的水分含量低，游離水較少，抑制了部分微生物(包括細菌和霉菌等)的生長，減少了肌肉組織的腐壞和脂肪的氧化與酸敗[23]，因此嗜酸乳桿菌發酵豬肉干的貨架期得到延長。

由表5、圖1和表6可知，經過單因素實驗優化后，烘烤溫度為95 ℃、烘烤時間為80 min的發酵豬肉干貨架期與烘烤溫度為105 ℃、烘烤時間為65 min的發酵豬肉干貨架期一致，但綜合含水率來看，烘烤溫度為105 ℃、烘烤時間為65 min的發酵豬肉干口感更好，所以此工藝條件更優。

整個實驗在30 ℃儲藏下進行，此溫度下大部分微生物生長迅速，食品的保質期受溫度的影響較大，溫度的升高或降低都會引起化學反應速率變化。本實驗相當于加速了發酵豬肉干腐敗的進程，而一般的肉干的貯藏溫度為20 ℃左右，相當于貯藏溫度提高了10 ℃，類似于進行了一次破壞性實驗，所以嗜酸乳桿菌發酵豬肉干在室溫下的貨架期將會更長。

3 結論

本實驗在不同的接種量、發酵溫度、發酵時間、烘烤溫度、烘烤時間條件下，用嗜酸乳桿菌對豬肉發酵制成豬肉干，以發酵豬肉干微生物指標為檢測對象，確定出嗜酸乳桿菌發酵豬肉干儲藏時間最長的工藝條件為：接種量1%、發酵時間60 h、發酵溫度40 ℃、烘烤時間65 min、烘烤溫度105 ℃。整個實驗進程中，發酵豬肉干并未添加任何防腐劑，不僅保障了發酵豬肉干的營養價值和安全性，一定程度上也為廠家出品新產品提供了廣闊的市場前景和生產依據。