建立檢測醬油中8種生物胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(LC-MS)

沙麗娜，吐爾洪·買買提，阿孜古麗·衣該木，艾買提江·阿衣甫別克，張明玥

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院，烏魯木齊 830011；2.新疆大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 能源材料化學(xué)教育部重點實驗室，烏魯木齊 830046)

生物胺(biogenic amine, BA)是一種有生物活性的、低分子量的、含氮有機化合物的總稱。生物胺對內(nèi)臟功能和免疫系統(tǒng)的代謝過程起著非常重要的作用，主要存在于各種各樣含蛋白質(zhì)比較豐富的食物中，比如乳制品類、飲料、魚產(chǎn)品類和各種發(fā)酵食品。據(jù)報道，生物胺是由原料中的微生物或者酶通過代謝產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用形成的。它不僅在各種動植物的組織中存在，也微量存在于人體中。目前雖然制定食品中生物胺禁限用標(biāo)準(zhǔn)比較困難，但部分國家已經(jīng)嘗試根據(jù)不同食品的特性給出生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。美國對水產(chǎn)品中組胺的限量為50 mg/kg，酪胺的限量范圍為100～800 mg/kg；歐盟對食品中組胺的限量為100 mg/kg，酪胺的限量范圍為100～800 mg/kg，對水產(chǎn)品中組胺的限量為100 mg/kg；而我國對鮐鲹魚中組胺的限量為1000 mg/kg，對其他海產(chǎn)魚類中組胺的限量為300 mg/kg。

醬油是一種世界流行的色、香、味俱全的液體調(diào)味品[1]，具有特殊的香氣、色澤、風(fēng)味和體態(tài)[2]，是人們在日常生活中獲取鹽類的一個重要來源[3]，也是經(jīng)常使用到的含有生物胺的發(fā)酵食品，有研究報道稱高含量的酪胺可能與生產(chǎn)醬油過程中衛(wèi)生條件不好有關(guān)，同時與尸胺和腐胺的高含量有關(guān)。人類食用到的微量的生物胺一般不會對自身造成不良影響，但積累到一定程度時，在體內(nèi)就會產(chǎn)生毒害作用，比如血壓變化、呼吸紊亂等不良反應(yīng)。但是目前現(xiàn)行有效的醬油檢測國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中卻沒有生物胺的相關(guān)檢測[4]，故以人體健康和食品安全為起點，建立一種簡易、靈敏、快速、高通量的生物胺含量檢測方法有重要的意義。

如目前多數(shù)方法一樣，食品中生物胺檢測現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.208-2016《食品中生物胺的測定》中樣品前處理需要衍生化[5-7]，有些需要固相萃取小柱凈化處理，而本次試驗采用連續(xù)三相液液萃取的前處理方法，簡單易行，毒害小。目前常用的檢測方法主要包括高效液相色譜法、生物傳感器法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、電化學(xué)法、離子色譜法、熒光光度法、分子印跡法和紫外可見光分光光度法等[8-15]。國標(biāo)檢測方法對于一些痕量的物質(zhì)無法進行定量分析，故本次試驗使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并做了方法學(xué)試驗。該方法檢測時間短，且質(zhì)譜法的檢測靈敏度要遠遠高于液相色譜法，提高了對一些含量較低的樣品檢測的準(zhǔn)確性，尤其對一些只需要定性檢測的樣品，提供了快速簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：色胺(純度98%)、尸胺(純度98%)、組胺(純度≥98%)、苯乙胺(純度99%)、腐胺(純度≥98%)、酪胺(純度≥98.5%)、精胺(純度≥97%)、亞精胺(純度≥98%)，均購自上海源葉生物科技有限公司；乙醇：分析純，天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；甲酸銨：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；乙酸銨：色譜純，ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai) Inc.；甲醇、乙腈：均為色譜純，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；品牌1及品牌2生抽醬油、紅燒醬油、老抽醬油、味極鮮和海鮮醬油：均購自本地超市。

1.1.2 試驗儀器

XEVO-TQS Micro型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；CPA 225D型電子分析天平(感量十萬分之一) 德國賽多利斯公司；RP-1D型磁力攪拌器 Wiggens Labortechnik公司；DMT-2500型渦旋混合儀 Miulab公司；MAXQ4000型震蕩搖床 美國Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水制備儀 美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備

分別稱取8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各約20 mg(精確至0.00001 g)，置于10 mL容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，再分別取適量制成系列濃度為1，5，10，20，50，100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流(total ion chromatography，TIC)圖見圖1。

圖1 8種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液TIC圖

1.2.2 供試品溶液的制備

取醬油樣品3 mL加入5 mL、pH值為13的氫氧化鈉溶液中，放在轉(zhuǎn)速為500 r/min的磁力攪拌器上，用二氯甲烷進行萃取，通過選擇性透過膜后，由于濃度差進入另一邊的二氯甲烷中，最終被反萃取至濃度為0.4 mol/L的鹽酸溶液中，最后用滴管小心將混有樣品的鹽酸溶液吸取出來，過濾，待測。具體萃取裝置圖見圖2。

圖2 萃取裝置及過程圖

1.2.3 試驗條件

表1 8種生物胺的質(zhì)譜檢測條件

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測得的供試品溶液中生物胺的峰面積值，帶入2.1得到的生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，計算出對應(yīng)的生物胺濃度，按照下式計算待測供試品中生物胺的含量ω：

式中：ω表示樣品中激素類組分的質(zhì)量分數(shù)，μg/g；ρ表示從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測組分的質(zhì)量濃度，μg/mL；V表示樣品定容體積，mL；m表示樣品取樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)試驗

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照“1.2.3”項下的試驗條件，將上述樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入液相色譜中，進行生物胺的含量檢測，所得的生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

表2 8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 精密度試驗

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)測定6次，記錄結(jié)果數(shù)據(jù)。測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的生物胺含量結(jié)果的RSD(n=6)為0.30%～0.86%。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

選取標(biāo)曲中間點(即濃度為20 ng/mL左右)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測量其在6，12，24，30，40，48 h時的峰面積，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的生物胺含量結(jié)果的RSD(n=6)為2.19%～6.44%。

2.1.4 檢出限與定量限

經(jīng)試驗驗證，選取標(biāo)曲的最低點(約1.0 ng/mL)作為生物胺的定量限(苯乙胺因響應(yīng)值較低，故其定量限約為3.0 ng/mL)；將標(biāo)曲最低點精密稱取3 mL，用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至10 mL容量瓶中，即濃度為約0.3 ng/mL作為儀器的檢出限(苯乙胺因響應(yīng)值較低，故其定量限約為1.0 ng/mL)。

2.1.5 加標(biāo)回收率

將8種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白樣品(與醬油基質(zhì)相同的純凈水)中，一般選取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點的濃度(本次試驗選取生物胺的濃度約為20 ng/mL)，分別平行加入6份空白樣品中，按照“1.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備，待測。得到的加標(biāo)回收率的具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 8種生物胺的加標(biāo)回收率結(jié)果(n=6)

2.1.6 樣品測定結(jié)果

購買了2個品牌10個批次的醬油，其中，生抽和老抽都是經(jīng)過釀造發(fā)酵加工成的醬油，紅燒醬油屬于老抽的一種；高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝適合制作生抽及味極鮮[16]，海天味業(yè)則以廣式高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝為主，該方法便于實現(xiàn)工業(yè)化、節(jié)約化、清潔化生產(chǎn), 并且釀制出的醬油呈香濃郁、品質(zhì)優(yōu)良[17]；海鮮醬油是以特級生抽醬油為主料，配以經(jīng)現(xiàn)代工藝提煉出的海魚蝦的精華液。按照“1.2.2”項下方法制成供試品溶液，按照“1.2.3”項下的試驗條件分別進行測定，記錄結(jié)果數(shù)據(jù)，結(jié)果見表4。

表4 市售10醬油中生物胺的含量(ng/mL)

由表4可知，不同品牌不同品種醬油中生物胺的種類和含量差異均較大，其中苯乙胺、腐胺和酪胺的相對含量較高，色胺和精胺的相對含量較低，但是沒有一種品牌的醬油是不含有生物胺的。有研究報道稱高含量的酪胺可能與生產(chǎn)醬油過程中衛(wèi)生條件不好有關(guān)，同時與尸胺和腐胺的高含量有關(guān)。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 有機溶劑的考察

選擇合適的有機溶劑是液-液萃取過程的關(guān)鍵因素，在連續(xù)三相液相萃取中，萃取溶劑應(yīng)滿足以下條件：分析物在該有機溶劑中有足夠大的溶解度；與水不互混溶，盡可量減少在萃取過程中的損失[18]；使用正L型萃取池時，有機溶劑的密度要大于水的密度，反之相反；毒性要低，避免對環(huán)境的污染及試驗操作人員的危害；與微孔濾膜不能發(fā)生作用；不與目標(biāo)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且穩(wěn)定性好。故本次試驗中考察了二氯甲烷、氯仿和四氯化碳萃取劑對生物胺萃取效率的影響。根據(jù)試驗結(jié)果選擇萃取率最高的二氯甲烷作為提取溶劑，具體試驗結(jié)果見圖3。

圖3 不同萃取溶劑對生物胺萃取率的影響

2.2.2 微孔濾膜的考察

在連續(xù)三相液相萃取過程中微孔濾膜的選擇非常重要，微孔濾膜應(yīng)該具有以下特征：微孔濾膜應(yīng)該是疏水性膜；不能與有機溶劑發(fā)生相互作用；微孔濾膜的厚度要適中，微孔濾膜太厚則透過率低，引起萃取效率的下降；如果微孔濾膜太薄，在萃取過程中容易引起誤差。微孔濾膜的孔徑也要適宜；孔徑太大會導(dǎo)致水和其他大分子雜質(zhì)物直接透過膜；如果孔徑太小會引起萃取效率的下降。試驗中考察了聚四氟乙烯(其中1號孔徑為37 μm，2號孔徑為106 μm)、聚丙烯、尼龍、不銹鋼網(wǎng)4種不同的膜對生物胺萃取率的影響。根據(jù)試驗結(jié)果選擇萃取率最高的聚四氟乙烯(2號孔徑為106 μm)作為微孔濾膜，具體試驗結(jié)果見圖4。

圖4 不同濾膜材質(zhì)對生物胺萃取率的影響

2.2.3 給體相pH的考察

給體相與接受相pH在液-液-液三相萃取中起到重要作用。液-液-液三相體系包含給體相、有機相、接受相3個液相，對于堿性分析物通過向給體相中加入堿調(diào)節(jié)給體相的pH值大于目標(biāo)物的pKa值，使目標(biāo)物去離子化以降低其在給體相中的溶解度。通過攪拌使給體相中的目標(biāo)分析物擴散并依靠疏水作用進入有機相，接受相中加酸是為了提供質(zhì)子在有機相和接受相界面使目標(biāo)分析物質(zhì)子化，則被萃取到接受相[19]。本文考察了給體相10～14范圍內(nèi)的pH值對生物胺萃取效率的影響。根據(jù)試驗結(jié)果選擇萃取率最高的13作為給體相的pH值，具體試驗結(jié)果見圖5。

圖5 不同給體相的pH對生物胺萃取率的影響

2.2.4 接受相鹽酸濃度的考察

鑒于接受相鹽酸濃度對生物胺萃取效率的影響，本文考察了接受相在0.1～0.5 mol/L范圍內(nèi)的鹽酸濃度對生物胺萃取效率的影響。根據(jù)試驗結(jié)果選擇萃取率最高的0.4 mol/L作為接受相的鹽酸濃度，具體試驗結(jié)果見圖6。

圖6 不同鹽酸濃度對生物胺萃取率的影響

2.2.5 攪拌速率的考察

攪拌速率是影響萃取效率的另一重要因素。由于攪拌增加接觸面從而可以提高萃取效率，尤其是連續(xù)三相液相萃取中，通過攪拌增加待測組分快速透過微孔濾膜并縮短平衡時間。同時，快速攪拌可能造成萃取劑的揮發(fā)損失與產(chǎn)生大量氣泡從而降低萃取效率。在試驗中選擇200，300，400，500，600 r/min 5個不同的攪拌速率進行考察。根據(jù)試驗結(jié)果選擇萃取率最高的500 r/min作為攪拌速率，具體試驗結(jié)果見圖7。

圖7 不同轉(zhuǎn)速對生物胺萃取率的影響

2.2.6 萃取時間的考察

一般隨時間的增長萃取效率也增大。但時間過長，有機溶劑揮發(fā)，不利于萃取。本試驗在5～50 min時間內(nèi)進行考察。根據(jù)試驗結(jié)果選擇萃取率最高的20 min作為萃取時間，具體試驗結(jié)果見圖8。

圖8 不同萃取時間對生物胺萃取率的影響

2.2.7 混勻方式的考察

一般的混勻方式有磁力攪拌、渦旋混勻及搖床振蕩3種方式，本次試驗對3種混勻方式對生物胺的萃取率比對進行了考察。根據(jù)試驗結(jié)果選擇萃取率最高的渦旋混勻作為混勻方式，具體試驗結(jié)果見圖9。

圖9 不同混勻方式對生物胺萃取率的影響

2.3 試驗條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的優(yōu)化

選取Waters公司的C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、C8(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)、HILIC(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)3種不同填料的色譜柱對8種生物胺進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HILIC柱及C8柱無法完全檢測出8種生物胺，最終選擇8種生物胺均可檢出的Waters公司的C18柱。

2.3.2 耐用性的考察

分別選取①C18(50 mm×2.1 mm，內(nèi)徑1.7 μm)、②C18(100 mm×2.1 mm，內(nèi)徑1.7 μm)、③C8(50 mm×2.1 mm，內(nèi)徑3.5 μm)、④C8(100 mm×2.1 mm，內(nèi)徑3.5 μm)4種型號和規(guī)格的色譜柱，對生物胺的系統(tǒng)適用性進行考察，包括色譜柱的理論板數(shù)(n)、分離度(R)、拖尾因子(T)等。試驗結(jié)果顯示①C18(50 mm×2.1 mm，內(nèi)徑1.7 μm)的色譜柱得到的理論板數(shù)、分離度及拖尾因子最好，因此選擇該規(guī)格色譜柱。

2.3.3 流動相的優(yōu)化

選取甲醇和乙酸銨水溶液(濃度為5 mmol/L)以及乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)兩種不同的流動相對8種生物胺進行檢測，結(jié)果表明，以乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)為流動相時，8種生物胺能獲得較好的峰形、分離效果和檢測靈敏度。因此，選擇乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)作為流動相。

2.3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)儀器自動調(diào)諧的結(jié)果進樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)還是有部分生物胺無法檢測出來，故需對自動調(diào)諧的結(jié)果進行微量的手動調(diào)諧，優(yōu)化質(zhì)譜調(diào)諧中的毛細管電壓、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等參數(shù)，根據(jù)響應(yīng)值的大小，確定最終的生物胺的質(zhì)譜檢測條件。按照試驗確定的質(zhì)譜方法中質(zhì)譜檢測條件(8種生物胺的母離子、碎片離子、錐孔電壓以及碰撞能等條件)，對毛細管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣流量和脫溶劑氣溫度進行4種數(shù)據(jù)的測試，并對生物胺的響應(yīng)值進行檢測，最終選擇1.2.3中的質(zhì)譜條件。

3 結(jié)論

采用的連續(xù)三相液液萃取法互補了膜分離和三相液液萃取技術(shù)的缺點，提高了方法的準(zhǔn)確性、靈敏度、選擇性，并且縮短了萃取時間，裝置簡單，成本低，膜過濾和兩次萃取同時完成，且重現(xiàn)性好。采用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為生物胺的檢測方法分析時間更短(10.0 min)，檢出濃度更低(苯乙胺為1.0 ng/mL，其余7種為0.3 ng/mL)，更適用于微量生物胺的檢測。本次方法學(xué)試驗檢測結(jié)果顯示8種生物胺的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；精密度RSD范圍為0.30%～0.86%；穩(wěn)定性RSD范圍為2.19%～6.44%；回收率范圍為87.02%～90.20%，說明采用此質(zhì)譜方法進行檢測結(jié)果良好，對8種生物胺具有普遍適用性。通過對上述市售的10批次醬油的檢測，證實本試驗的樣品提取方法簡單、快速，可用于醬油中8種生物胺的檢測，同時可以繼續(xù)推廣作為紅酒、牛奶、飲料及果汁等其他液態(tài)食品中8種生物胺的檢測方法。