離子對液相色譜法檢測烹調香料中非法摻雜的罌粟殼

睢超霞，陳蕾，徐娜

(河南醫學高等?？茖W校 藥學系 化學教研室，鄭州 451191)

烹調香料是某些植物的種子、果實、根等組織，添加在食物中具有去腥、除膻、解膩、增香、提鮮等功能。罌粟殼俗稱大煙殼，系罌粟科植物罌粟的干燥成熟果殼，內含嗎啡、可待因、罌粟堿等多種生物堿。罌粟殼中的生物堿雖然含量較低，但長期食用會出現盜汗、乏力、犯困等癥狀，嚴重時可能對神經系統和消化系統造成損害[1]。近年來屢有不法商販在烹調香料中摻雜罌粟殼，制成所謂的秘制配方售賣，作為調味品在火鍋料、鹵料和湯汁中使用，用于招攬生意，牟取暴利[2]。2009年國家食品藥品監督管理局發布《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單》，嚴禁將罌粟殼作為食用添加劑。

罌粟殼研磨成粉末后摻入烹調香料，常規的形態鑒別法難以準確辨別是否違法添加。罌粟殼中富含罌粟堿、嗎啡、可待因等生物堿成分，判斷是否違禁使用罌粟殼可以通過測定罌粟殼中的生物堿來判斷。目前，測定罌粟殼中生物堿的方法有光譜法、電化學分析法、免疫分析法和色譜法等[3]。與其他分析方法相比，色譜法采用先分離后測定技術，能夠排除樣品中其他雜質的干擾，是鑒別食品中是否違法添加罌粟殼的最佳方法。沈平等[4]采用氣相色譜-質譜聯用法，檢測了罌粟殼提取物中罌粟堿、蒂巴因等生物堿組分。林黛琴等[5]采用液相色譜-電噴霧串聯四極桿質譜法定量檢測摻雜罌粟殼食品中多種生物堿的殘留。色譜-質譜聯用法具有分析效率高、選擇性好、檢測靈敏度高等優勢，但是色譜-串聯質譜儀價格昂貴，操作步驟復雜，對操作人員的要求較高，在基層實驗室難以開展。罌粟堿是罌粟殼特有的標志性組分，在罌粟殼中含量較高，具有興奮、鎮痛等麻醉作用，通過測定罌粟堿的含量可初步鑒別烹調香料是否違法添加罌粟殼。本研究采用基層實驗室最常用的液相色譜儀，以己烷磺酸鈉為離子對試劑，通過優化色譜條件，建立靈敏可靠、快速準確的液相色譜方法來測定罌粟堿，該方法適用于烹調香料中違禁成分罌粟殼的篩查與鑒別，可供基層實驗室參考借鑒，為預防和減少摻雜罌粟殼的烹調香料造成的健康危害提供了檢測技術手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鹽酸罌粟堿對照品(定值100%)：中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)、己烷磺酸鈉(>98.0%)：Merck公司；鹽酸三乙胺(≥99%)：Sigma公司；其他試劑為優級純或分析純，實驗用水符合國家標準GB/T 6682-2008的要求。

Alliance 2695高效液相色譜儀 Waters公司；TU-1901雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；CT15RE高速離心機 Hitachi公司。

1.2 色譜條件

Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相(A∶B為40∶60)：其中流動相A為0.02 mol/L戊烷磺酸鈉水溶液(稱取3.48 g的己烷磺酸鈉，去離子水溶解后加入2.0 mL的三乙胺，磷酸調pH至3.5，0.45 μm濾膜過濾后去離子水定容到1000 mL)，流動相B為甲醇；色譜柱溫度為30 ℃；檢測波長為240 nm；進樣體積為10 μL；流動相流速為1.0 mL/min。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取2.5 mg鹽酸罌粟堿標準品至25 mL容量瓶中，甲醇定容，制成100 μg/mL的罌粟堿對照品儲備液。采用流動相將儲備液稀釋到0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 μg/mL，制成標準應用液。

1.4 樣品處理方法

首先配制1000 mL甲醇-乙酸混合提取溶劑(溶液中含甲醇70%，乙酸2%，水28%)。烹調香料樣品經研磨后過3號篩，精密稱取樣品粉末2.0 g，置于50 mL棕色錐形瓶中，加入20 mL提取溶劑，室溫浸泡24 h，超聲波(功率250 W，頻率40 kHz)提取30 min，5000 r/min離心10 min，將上清液用濾紙過濾后置于100 mL棕色容量瓶中，按上述步驟提取3次，合并上清液后將提取溶劑定容到刻度，微孔濾膜(0.45 μm)過濾后進行HPLC 分析。

2 結果與分析

2.1 罌粟堿的光譜性能

檢測波長的選擇影響液相色譜分析方法的靈敏度，現有文獻檢測罌粟堿采用的波長有253，210，240 nm等[6-8]。罌粟堿的吸收光譜和溶劑有關，本研究采用流動相配制50 μg/mL的罌粟堿溶液，在200～400 nm范圍內掃描紫外光吸收，結果見圖1。罌粟堿在200～340 nm之間有紫外吸收，最大特征紫外吸收波長為239 nm，罌粟堿在此波長下的檢測靈敏度最高，是罌粟堿檢測的最佳波長。

圖1 罌粟堿的紫外吸收光譜圖

2.2 流動相的選擇

罌粟堿屬于生物堿，在酸性溶液中質子化后以陽離子形式存在，具有較強的親水性。當以純水-甲醇(或乙腈)為流動相時，色譜峰出峰時間較早，同時罌粟堿的胺基與色譜柱固定相表面殘存的硅醇基發生相互作用，吸附在色譜柱的固定相上，造成色譜峰拖尾現象。

通過在流動相中添加離子對試劑可以改善分離效果，己烷磺酸鈉中的極性磺酸根陰離子基團與罌粟堿的胺基陽離子基團締合形成中性分子，增加樣品離子在非極性固定相中的溶解度，增強其保留作用，改善分離效果。同時在流動相中加入0.2%的三乙胺作為峰形改進劑，三乙胺可與色譜柱固定相表面的殘留硅醇基結合，一定程度上抑制了罌粟堿與硅醇基的吸附作用，起到改善峰形的作用。

不同流動相下罌粟堿的色譜流出曲線見圖2。

圖2 不同流動相條件下罌粟堿的色譜流出圖

由圖2可知，添加離子對試劑后，色譜峰的保留時間延長，色譜峰形的對稱性有所改善，增加了色譜定性和定量結果的準確性。本實驗的流動相采用二元等度法，流動相比例A∶B為40∶60，其中流動相A為離子對水溶液(0.02 mol/L己烷磺酸鈉溶液，含0.1%三乙胺，磷酸調pH至3.5)，流動相B為甲醇。

2.3 校正曲線的建立

按照1.2部分設定的色譜參數進樣罌粟堿對照品，色譜峰見圖3。罌粟堿在6.75 min出峰，標準樣品的峰形呈正態分布且對稱性良好，基本無拖尾現象。標準系列測試結果表明，在0.05～5.0 μg/mL范圍內，罌粟堿濃度和色譜峰面積呈線性關系，以峰面積對標準溶液的濃度作圖并線性擬合工作曲線；回歸方程為Y=39815X+472擬合時要求相關系數大于0.995。

圖3 罌粟堿對照品、空白烹調香料樣品和加標樣品的色譜圖

同時將建立的液相色譜方法應用于空白烹調香料樣品和加標烹調香料樣品的測試，色譜流出曲線見圖3。由樣品色譜圖可知，加標樣品中的罌粟堿與空白樣中其他雜質成分得到了基線分離，分析方法專屬性良好。色譜峰正態對稱分布，與標準溶液的保留時間基本一致(偏差<2.0%)。將加標樣品色譜峰高稀釋到3倍樣品空白噪聲(S/N=3)，計算出方法的檢出限為0.01 mg/L。

2.4 方法的驗證

2.4.1 樣品的提取

罌粟殼中生物堿常用的提取方法有索氏提取法[9]和超聲波提取法[10]，索氏提取法屬于加熱回流萃取方法，優點是設備簡單，缺點是耗時，需要的提取溶劑也較多，對中藥材的提取效率較差。超聲波獨具的物理特性能促使植物細胞組織破壁或變形，提高有效成分的提取效率，通常在30 min即可獲得最佳提取率，同時提取溫度較低，對易水解或氧化的待測成分具有保護作用。

常用的罌粟殼中生物堿的提取溶劑有純水、甲醇、乙醇和乙酸[11]，設計單因素實驗考察各種溶劑的提取效率，固定浸泡時間為24 h，超聲提取時間為1 h，考察各種提取溶劑的提取效率，結果發現采用甲醇和乙酸混合溶劑(溶液中含甲醇70%，乙酸2%，水28%)的提取率最高。采用超聲波提取儀和甲醇-乙酸混合溶劑提取烹調香料的生物堿，提取過程見1.4。

2.4.2 加標樣品的檢測

測定市售3種烹調香料中的罌粟堿，配制加標樣品，測定樣品中罌粟堿的加標回收率和檢測精密度。烹調香料調味品中添加不同含量的罌粟殼，分別在3份烹調香料中加入1.0，2.0，5.0 mL的100 μg/mL罌粟堿儲備液，樣品中罌粟堿的加標量分別為100，200，500 μg，按照1.4部分所示提取樣品中的罌粟堿，并將樣品稀釋到校正曲線的線性范圍以內，液相色譜測試結果見表1。

表1 樣品含量和加標回收測試

由表1可知，3種不同加標水平樣品中罌粟堿的回收率為78.5%～91.2%，檢測結果平行測定7次的精密度為0.9%～1.4%，精密度和加標回收率代表著分析方法的精密度和準確度，建立的離子對液相色譜法能夠準確可靠地檢測烹調香料中非法摻雜的罌粟殼。

3 結論

近年來，在火鍋底料、鹵制品中添加罌粟殼得到了關注，目前還沒有罌粟殼在食品中違法添加的國家標準檢測方法，上海市食品藥品監督管理局發布了食品安全地方標準(DB31/2010-2012)[12]，該標準采用液相色譜-串聯質譜同位素內標法測定了罌粟堿、嗎啡等罌粟殼中含有的生物堿，適用于火鍋中非法添加罌粟殼的鑒定，缺點是儀器價格昂貴，基層實驗室無法普及。罌粟殼粉摻雜在烹調香料中制作秘制配方的危害面嚴重，需要建立相應的簡單快速的檢測方法。高效液相色譜儀在基層較為普及，儀器易于操作，檢測過程方便快速。本實驗建立了離子對液相色譜法檢測罌粟殼中的標志性成分罌粟堿，選用己烷磺酸鈉作為離子對試劑，增強了罌粟堿的保留，同時加入三乙胺作為峰形改進劑，減少了色譜峰的拖尾。本方法操作簡單，檢測靈敏度高，且精密度和重復性均較好，有利于推廣應用。