GC-MS法分析枯草芽孢桿菌HS8揮發性成分

萬璐，閆佳佳，許哲祥，姜碩，鄭春英*

(1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學 生命科學學院，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080)

作為常用益生菌之一，枯草芽孢桿菌廣泛存在于自然界中[1]，屬于革蘭氏陽性非致病菌[2]，既不引起人和動物產生疾病，也不污染環境[3]，還能產生多種抗生素及廣譜抗菌活性的抑制性酶[4]，同時，枯草芽孢桿菌具有較強的抗逆性，能夠耐受機體、生產、運輸、保存等過程中遇到的各種不良環境條件的變化[5]，在藥品生產、食品發酵、調味品等方面被廣泛應用[6-8]，產生了巨大的生態效益、經濟效益和社會效益[9]。

枯草芽孢桿菌HS8(BacillussubtilisHS8)為黃芪內生細菌，具有明顯、清新、持久、愉悅的香味，為了開發枯草芽孢桿菌HS8并合理利用其芳香氣味，本文以黃芪生藥為對照，采用GC-MS法分析枯草芽孢桿菌HS8的揮發性成分，系統分析比較枯草芽孢桿菌HS8揮發性成分與宿主植物黃芪之間的相關性，并確定其芳香活性物質，旨在合理開發新型芳香性枯草芽孢桿菌調味品，為擴大枯草芽孢桿菌的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌HS8(BacillussubtilisHS8)：由黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室分離自健康黃芪植株；健康野生膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)：采自黑龍江省大興安嶺地區；NA、NB培養基配制方法參閱文獻[10]；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

7890A GC-240MS GC-MS 聯用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

枯草芽孢桿菌HS8發酵液樣品的制備：參閱文獻[11]，將HS8菌株接種于NA培養基，于37 ℃條件下恒溫活化培養3 d，取活化后的HS8菌株，在無菌條件下挑取菌絲體接種于60 mL NB培養基中，于37 ℃、120 r/min條件下搖床振蕩培養3 d，制成1×107CFU/mL的培養液；將種子液以5%(V/V)的接種量轉接至300 mL滅菌后的NB培養基中，于37 ℃、120 r/min搖床培養5 d，將發酵液真空抽濾后，于50 ℃條件下減壓濃縮，將濃縮后的HS8菌株發酵液用乙酸乙酯萃取3次(3×100 mL)，合并萃取液，于50 ℃低溫濃縮至干，用適量乙酸乙酯溶解，作為發酵液供試樣品，備用。

枯草芽孢桿菌HS8菌絲體樣品的制備：分別提取HS8菌株菌絲體，超聲破碎，并以乙酸乙酯萃取3次(3×100 mL)，合并萃取液，以下步驟同“枯草芽孢桿菌HS8發酵液樣品的制備”，作為菌絲體供試樣品，備用。

對照藥材溶液的制備：分別稱取黃芪根及黃芪莖的干燥粉末各10 g，加入乙酸乙酯100 mL，超聲提取1 h，過濾后于50 ℃減壓濃縮至10 mL，用0.45 μm有機微孔濾膜過濾，作為黃芪對照藥材液，冷藏備用。

空白對照品溶液的制備：取NB培養基(不接種內生細菌)，于50 ℃減壓濃縮，同“枯草芽孢桿菌HS8發酵液樣品的制備”處理，作為培養基空白對照品，備用。

1.3.2 GC-MS條件

MS條件：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲2.5 min；數據采集方式為Scan；檢測器增益電壓1.18 kV；質量掃描范圍40～450 m/z。

1.3.3 分析測試

采用 GC-MS對HS8菌株揮發性成分進行分析，質譜峰數據經質譜數據庫檢索比對[12]，確定樣品揮發性成分中的主要成分，使用面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 揮發性成分總離子流圖

采用GC-MS法，分別對枯草芽孢桿菌HS8發酵液、菌絲體、黃芪根、黃芪莖及空白培養基對照品進行揮發性成分分析，其總離子流圖見圖1～圖5。

圖1 HS8發酵液揮發性成分GC-MS總離子流圖

圖2 HS8菌絲體揮發性成分GC-MS總離子流圖

圖3 黃芪根部揮發性成分GC-MS總離子流圖

圖4 黃芪莖揮發性成分GC-MS總離子流圖

圖5 NB培養基揮發性成分GC-MS總離子流圖

由圖1～圖5可知，枯草芽孢桿菌HS8發酵液中分離出揮發性物質37種，鑒定了其中的21種成分；菌絲體中分離出22種，鑒定了其中的18種成分；黃芪根中分離出揮發性物質16種，鑒定了其中的14種成分；黃芪莖中分離出34種，鑒定了其中的17種成分；空白培養基中含有7種揮發性物質，鑒定了其中的4種成分。

2.2 枯草芽孢桿菌HS8揮發性成分分析

以宿主植物黃芪為對照，對枯草芽孢桿菌HS8揮發性成分進行分析，結果見表1和表2。為排除培養基中成分對分析結果的干擾，同法對空白培養基也進行了揮發性成分的分析，結果見表3。

表1 枯草芽孢桿菌HS8揮發性成分GC-MS分析結果

表2 黃芪揮發性成分GC-MS分析結果

表3 NB培養基揮發性成分GC-MS分析結果

對比表1～表3分析結果可知，除去與培養基中相同的揮發性成分，在枯草芽孢桿菌HS8發酵液及菌絲體揮發性成分中均含有與黃芪根、莖相同的正二十七烷；同時，在枯草芽孢桿菌HS8菌絲體揮發性成分中檢測出β-谷甾醇，而在黃芪根揮發性成分中卻存在γ-谷甾醇；此外，枯草芽孢桿菌HS8發酵液及菌絲體揮發性成分中還存在其特異性揮發性成分。

3 結論

分離自健康野生黃芪植株的枯草芽孢桿菌HS8可產生清新、愉悅、持久的香味，GC-MS分析表明，枯草芽孢桿菌HS8含有大量揮發性成分，這些成分中存在著與宿主植物黃芪相同、相似及全新的揮發性成分，說明枯草芽孢桿菌HS8與宿主植物黃芪可能具有相同的代謝機制。作為農業部和FDA認定的安全性菌株[13,14]，枯草芽孢桿菌的開發與利用正在成為當今研究的熱點之一，上述研究為枯草芽孢桿菌HS8作為益生菌在調味香料的生產方面奠定了基礎[15]，提供了新資源，不僅能夠彌補調味香料植物生產方面的不足，同時也為內生細菌與宿主植物的互作機理提供了研究基礎。