超聲波輔助熱加工泡椒豬肝中優勢腐敗菌的分離鑒定及抑菌試驗

任政偉，王藝華，劉春燕，丁捷*，劉浩宇，陳美玲

(1.四川旅游學院 食品學院，成都 610100；2.浙江海洋大學 食品與醫藥學院，浙江 舟山 316000)

泡椒豬肝營養豐富，屬于低溫加工肉制品，且泡椒類產品深受群眾喜愛。近年來，許多研究人員對泡椒豬肝的加工工藝進行了大量的研究[1]。林坤等[2]對臘豬肝類休閑食品的加工技術進行了研究；盧雪松等[3]優化了泡椒豬肝的生產工藝；崔瑞穎等[4]采用添加劑影響豬肝醬品質。戚彪等[5]的研究表明微波殺菌與高溫殺菌相比較，品質變化較小。Hanieh等[6]在研究中發現超聲波結合水蒸氣的處理方法，其菌落總數可以減少3個對數級。Smith等[7]在研究中發現，高強度超聲和抗菌劑的結合使用可以使病原菌的殺滅效果更好。Morild等[8]在研究中發現，在持續高功率超聲結合處理后，豬皮和肉表面的病原菌明顯減少。隨著生活質量的提高，人們對泡椒類產品的需求增大，而改善產品的風味品質已經迫在眉睫[9-11]。

課題組前期將超聲波熱處理應用于真空低溫烹飪領域獲得了良好的研究成果，尤其針對豬肝、鳳爪等經過多次熱處理、極易造成其質構特性等感官狀態下降的原料，有效改良了其成品的質構特性[12,13]。在超聲波低溫真空技術加工肉制品的過程中，超聲波可同時起到殺菌和進一步熟化的作用，但殺菌效果有限，無法完全殺死產品中耐熱的芽孢菌。因此，分離鑒定超聲波熱處理肉制品中腐敗菌，同時進行天然成分的抑菌試驗，對進一步延長該技術處理后肉制品的保質期具有重要意義。目前，該類型研究報道尚屬空白領域。本試驗通過從超聲波低溫真空技術加工泡椒豬肝中，分離篩選獲得優勢腐敗菌，并對其進行形態學和分子生物學的鑒定，確定種類，并建立生長曲線，進行天然抑菌物質的篩選，為延長超聲波輔助真空低溫烹飪產品的保質期提供了理論依據，為后續復配天然抑菌劑的研發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肝、泡椒：購于成都市龍泉驛區平安菜市場；培養基配方藥品：北京奧博星生物科技有限公司；可溶性淀粉：成都市科隆化工試劑廠；蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸石炭酸棉藍染液、酪蛋白、酪氨酸、結晶紫：天津市致遠化學試劑有限公司；茶多酚、醋酸、檸檬酸、乳酸：均為分析純，由成都鵬世達實驗用品有限公司提供；過氧化氫、95%乙醇：國藥集團化學試劑有限公司。所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SHP0201147047型電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；BH200型微生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；YX-280A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；QYC-2102C型搖床 上海?，攲嶒炘O備有限公司；202-3AB型電熱恒溫干燥箱 余姚市東方電工儀器廠；S-3C型pH計 成都世紀方舟科技有限公司；S1000型PCR擴增儀、Gel-Doc-200型凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司；DY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；牛津杯(外徑 8 mm，內徑6 mm，高 10 mm) 上海申賢恒溫設備廠；LRH-280 型生化培養箱 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

新鮮豬肝→切片(切成約0.3 cm×0.5 cm×0.2 cm厚的柳葉)→流水沖洗(1 h)→焯水(姜10 g，蔥20 g，料酒40 g，鹽1 g，100 ℃，20 min)→腌制液浸泡(12 h)→晾干→分裝(150 g/袋)→真空包裝→超聲波加熱處理→冷卻→成品。

1.3.2 菌株分離

將成品豬肝置于37 ℃恒溫培養箱中貯藏，培養72 h后稱取25 g樣品放在225 mL無菌生理鹽水的無菌均質杯內，80000 r/min 均質2 min。用無菌吸管吸取1 mL菌液于9 mL無菌蒸餾水中，依次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度大小的菌懸液。再分別吸取0.1 mL不同稀釋濃度下的菌懸液于營養瓊脂培養基上進行涂布，用于菌種的分離，在37 ℃下培養48 h后，挑選菌落形態大小不同的微生物進行純化培養。

1.3.3 優勢腐敗菌的鑒定

1.3.3.1 菌落及形態特征觀察

在無菌操作的條件下，將優勢腐敗菌接種在營養瓊脂培養基上，進行涂布，37 ℃培養48 h，觀察菌落大小、形態、顏色等并做好記錄。

再對菌落按照革蘭氏染色的方法對菌株進行染色，判斷其為革蘭氏陽性菌還是陰性菌，并觀察單個菌種的形態。嚴謹觀察、描述、拍照、記錄。

1.3.3.2 生理生化試驗

對分離出的主要腐敗菌根據其特性進行了糖發酵、V.P、甲基紅、酶促、吲哚、明膠液化等生理生化試驗對菌株進行鑒定。

1.3.3.3 16S rDNA菌種鑒定

將所得菌株送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。所得序列利用Blast程序，將所測定菌株的16S rDNA序列同GenBank中已提交的序列進行Blast N分析和同源比對，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，進一步確定菌株的種屬性質。

1.3.4 抑菌試驗

1.3.4.1 供試菌種菌懸液的制備及培養

用高溫滅菌并冷卻的接種環從斜面培養基上分別刮少量活化的菌種，分別接種在不同的液體培養基中，在搖床中培養48 h 后，置于4 ℃恒溫箱中備用。

1.3.4.2 抑菌劑濃度試驗

通過固體平板擴散法，分別考察乳酸溶液(1%、2%、3%、4%、5%)、檸檬酸溶液(1%、2%、3%、4%、5%)、醋酸溶液(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、茶多酚溶液(1%、2%、3%、4%、5%)對超聲波輔助熱處理豬肝中優勢腐敗菌的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 優勢腐敗菌的分離篩選

通過分離純化，獲得優勢腐敗菌7種，分別將其編號為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7。進行革蘭氏染色后，將微生物置于顯微鏡的油鏡下觀察。

2.2 優勢腐敗菌的鑒定

對分離出的7種腐敗菌的菌落形態進行觀察鑒定，其形態特征見表1。

表1 主要腐敗菌的形態描述

2.3 生理生化和形態特征

對分離出的主要腐敗菌進行生理生化試驗，對菌株進行鑒定，其結果見表2。

表2 主要腐敗菌的生理生化試驗結果

2.4 分子鑒定結果及優勢腐敗菌分析

對7種腐敗菌進行16S rDNA鑒定，并繪制生長樹，其結果見圖1。

圖1 主要腐敗菌發育樹構建

根據試驗步驟，篩選得到7種主要腐敗菌，并得到各個菌種的16S rDNA序列。將各個菌種的16S rDNA序列在CNBI基因庫中進行同源性比較，獲得與菌種序列相似度最高的菌株，即初步認定該菌株種類。從中選取若干個相似性高的菌株序列，使用軟件，通過鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹。

7種腐敗菌的測序結果見表3。

表3 主要腐敗菌的測序結果

結合圖1和表3不難發現X4、X5與Bacillussubtilis同源性最高，X1與Paenibacilluspolymyxa同源性最高，X2與Pseudomonasfragi同源性最高，X6與Bacillussp.同源性最高。泡椒豬肝是低溫加工肉制品，低溫熱處理對芽孢桿菌屬這種穩定性好、耐氧化、耐擠壓、耐高溫的微生物較難完全殺滅，因此在后期的貯藏及運輸過程中，一旦條件適宜或者受到污染，就會迅速生長繁殖，造成食品的腐敗變質[14]。莓實假單胞菌屬于假單胞菌屬，因其更適應低溫環境，所以在泡椒豬肝加工過程中極易繁殖，是低溫加工肉制品的典型腐敗菌。高磊等[15]研究發現假單胞菌是冷鮮雞腿肉中的優勢腐敗菌。Wang Guangyu等[16]發現，在有氧冷藏條件下的黃羽雞肉中，假單胞菌屬是優勢腐敗菌，莓實假單胞菌對其具有較強的致腐能力。很多研究文獻表明，芽孢桿菌和假單胞菌是肉制品中的主要腐敗菌[17-19]。

2.5 固體平板擴散法試驗結果

2.5.1 不同濃度乳酸抑菌液對幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為1%～5%的乳酸對5種腐敗菌的抑制效果見表4。

表4 不同濃度乳酸抑菌液對5種腐敗菌的抑制效果

由表4可知，乳酸對這5種腐敗菌均有一定的抑制作用，5種腐敗菌伴隨著乳酸抑菌劑濃度的增加，所對應的抑菌圈均呈現由小變大的趨勢。對于X1，濃度為5%時抑菌圈大小約為1%濃度的1.5倍；對于X2，濃度為5%時抑菌圈大小約為1%濃度的1.93倍；對于X4，濃度為5%時抑菌圈大小約為1%濃度的1.5倍；對于X5，濃度為5%時抑菌圈大小約為1%濃度的1.7倍；對于X6，濃度為5%時抑菌圈大小約為1%濃度的1.9倍。根據抑菌圈平均值大小可以初步判斷其對5種腐敗菌的抑制效果都比較強。

2.5.2 不同濃度檸檬酸抑菌液對幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為1%～5%的檸檬酸對5種腐敗菌的抑制效果見表5。

表5 不同濃度檸檬酸抑菌液對5種腐敗菌的抑制效果

由表5可知，檸檬酸對這5種腐敗菌都有一定的抑制作用，但效果不佳，且濃度較低時無法起到抑菌作用，尤其是在濃度為1%和2%時根本無法測量其抑菌圈大小，濃度提高后雖能測量出來抑菌圈大小，但效果依然不明顯。

2.5.3 不同濃度醋酸抑菌液對幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為0.5%～2.5%的醋酸對5種腐敗菌的抑制效果見表6。

表6 不同濃度醋酸抑菌液對5種腐敗菌的抑制效果

由表6可知，醋酸對這5種腐敗菌都有十分強的抑制作用，在濃度較低時也可以看到明顯的抑菌圈。5種腐敗菌隨著醋酸濃度的增加，所對應的抑菌圈均呈現逐漸增大的趨勢。對于X1，濃度為2.5%時抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.3倍；對于X2，濃度為2.5%時抑菌圈大小約為0.5%濃度的3.4倍；對于X4，濃度為2.5%時抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.9倍；對于X5，濃度為2.5%時抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.7倍；對于X6，濃度2.5%時抑菌圈大小約為0.5%濃度的1.7倍。根據抑菌圈平均值大小可以初步判斷其對5種腐敗菌的抑制效果都比較強。

2.5.4 不同濃度茶多酚抑菌液對幾種腐敗菌的抑制效果

濃度為1%～5%的茶多酚對5種腐敗菌的抑制效果見表7。

表7 不同濃度茶多酚抑菌液對5種腐敗菌的抑制效果

由表7可知，低濃度的茶多酚溶液對多粘類芽孢桿菌和兩種枯草芽孢桿菌的抑制作用均不明顯，甚至在濃度低時幾乎無抑制作用；因為茶多酚溶液顏色較深，抑菌圈不易觀察，因此在測量抑菌圈大小時容易造成誤差。

3 結論

本試驗采用十倍稀釋涂布法，篩選超聲波低溫真空技術加工的泡椒豬肝中的主要腐敗菌，對其進行菌落、顯微鏡形態觀察以及16S rDNA片段擴增和序列分析技術，最終確定多粘類芽孢桿菌(X1)、莓實假單胞菌(X2)、3種枯草芽孢桿菌(X4、X5、X6)5種優勢腐敗菌；通過平板擴散法研究乳酸、醋酸、檸檬酸和茶多酚對5種優勢腐敗菌的抑菌效果，其中乳酸、醋酸這兩種抑菌劑對這5種腐敗菌均有較好的抑菌效果，且能明顯觀察并測量出抑菌圈大小；綜合分析確定乳酸、醋酸對5株腐敗菌的最低抑制濃度分別為2.0%、2.0%。

本次試驗所測數據將為后面復配抑菌劑提供理論依據，為接下來復配抑菌劑的研究奠定基礎，篩選出能使泡椒豬肝貯藏更長時間的復配抑菌劑。在后續試驗中添加使泡椒豬肝貯藏時間更長，有效延長泡椒豬肝的保質期。