PCR-DGGE法分析酸菜中酵母菌微生物的多樣性

趙虎威，燕平梅

(太原師范學院 生物系，太原 030619)

酸菜作為中國傳統的一道發酵蔬菜，一直以來都深受人們喜愛。傳統酸菜具有濃郁的酸香，既清爽又可口。更重要的是酸菜汁具有清熱解暑、增強食欲、健脾、通腸道防便秘、降低血脂和膽固醇等有益身體的功效[1]。酸菜是由酵母菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、醋酸桿菌等發酵生成的[2]，在不同的發酵時期每種微生物所起的作用不同，因此使酸菜具有獨特的風味[3]。有研究表明酸菜發酵過程中真菌種類比細菌種類少[4]，德巴利漢遜酵母(Debaryomyceshansenii)是真菌中的優勢種[5]。前人對酸菜中細菌的研究較多，但對真菌的研究較少，因此本實驗選擇對真菌中的酵母菌進行研究。

隨著分子生物學快速發展，人們更多地從分子和基因水平研究酵母菌的遺傳組成和分類。26S rDNA在細胞內有很大的拷貝數，使擴增更容易，能用于近親緣關系菌株的分類，目前這一區域的應用較廣泛[6,7]。一些研究表明分子生物學PCR-DGGE可用于研究酸菜中的酵母菌[8,9]。付琳琳采用PCR-DGGE方法研究泡菜中微生物時發現泡菜中不僅存在乳酸菌，還有其他微生物。

因此本實驗采用非培養方法，利用PCR-DGGE技術對酸菜中酵母菌的多樣性進行研究[10]。通過一系列方法對酸菜中酵母菌的豐富度、多樣性、均勻性進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與器材

廣樂牌泡酸菜(青菜、水、食用鹽、調味料酒、香辛料、食品添加劑) 500 g(用SA標記)；松源牌酸菜(白菜、水、料酒、食鹽、蔥、姜、八角、桂皮、花椒、辣椒、香葉、小茴香) 500 g(用SB標記)；青菜酸菜(青菜、水、食用鹽、生姜片)500 g(用SC標記)；白菜酸菜(白菜、水、蔥、八角、姜片、鹽、味精)500 g(用SD標記)。

TC-96/G/H(b)B型PCR儀；DYY-6C型電泳儀；凝膠成像系統(DcodeTM)、The DcodeTMUniversal Mutation Detection System 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸菜汁中酵母菌DNA的提取

分別取4種泡菜汁18 mL在超凈工作臺上經無菌濾紙過濾裝入9個2 mL離心管中，8000 r/min離心5 min。離心后棄去上清液，將所得沉淀用移液槍收集到一個離心管中，再次離心，棄去上清，小心吸干多余的上清液。用天根生化科技有限公司的離心柱型試劑盒提DNA，在4 ℃保存。配制瓊脂糖TAE比值為1%的膠，檢測DNA。

1.2.2 26S rDNA的PCR擴增

引物：NL1-GC (cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g)；LS 2 (att ccc aaa caa ctc gac tc)。

反應體系：NL 1-GC 1 μL,LS 2 1 μL,DNA 1.5 μL, PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9 μL。

各取PCR產物3.5 μL，按照1.2.1的方法進行瓊脂糖凝膠電泳分析。由Marker可知DNA片段長度。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

變性梯度凝膠的配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方

DGGE電泳后凝膠于Bio-Rad公司的凝膠成像系統分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收，溶膠后作為模板通過PCR反應擴增26S rDNA片段，純化后與pGM-T Vector進行連接，轉化感受態細胞。將檢測陽性克隆的送到華大基因公司進行基因序列測定。

1.2.4 DGGE圖譜分析

用Quantity One分析凝膠成像儀拍出的照片。

計算多樣性指數(H)、均勻度指數(D)、豐富度指數(R)。

多樣性指數(H)[11]的計算公式：

H=-∑(ni/N)In(ni/N);

E=H/InS;

R=S-1/InN。

式中：ni為單一條帶的峰面積，N為某一泳道所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數。

2 結果分析

2.1 酵母菌微生物總DNA提取

分別取3 μL的DNA與0.5 μL的溴酚藍緩沖溶液混合后點樣，在110 V下電泳35 min，用紫外觀察儀觀察并拍照，結果見圖1。

圖1 酸菜微生物總DNA的提取

由圖1可以看到清晰的1條帶，說明成功提取到DNA，可以進行后續實驗。

2.2 酵母菌PCR擴增條帶

各取4種PCR產物3 μL，按照1.2.1的方法進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖2。

圖2 26S rDNA的PCR電泳圖

根據與Marker的對比可知DNA片段大小在270 bp左右，而且條帶寬度、亮度都不一樣，說明DNA濃度不一樣。擴增產物在紫外成像儀下可以清晰地看到1條帶，說明擴增成功，可以進行DGGE實驗。

2.3 DGGE圖譜分析

DGGE結果見圖3。

圖3 酸菜酵母菌26S rDNA的DGGE圖譜

條帶的寬度、亮度不同，表示DNA濃度不同。由圖3可知，共檢測出了13條帶。酸菜1檢測到3條帶，但有效回收2條，如SA1、SA2，即有3種酵母菌；酸菜2檢測出3條帶SB1、SB2、SB3，即有3種酵母菌；酸菜3中檢測出4條帶，即有4種酵母菌；酸菜4中有3條帶，即有3種酵母菌。說明酸菜3中酵母菌含量較豐富，但整體來說差距不是很大。SA2與SD2、SB2與SC2、SB1與SC1位置相同，為同一種酵母菌。酸菜A中SA2的亮度最亮，說明酵母菌SA2在酸菜A中含量豐富；酸菜B中SB2的亮度最亮，說明酵母菌SB2在酸菜B中含量豐富。可見，同一種酵母菌在不同的酸菜中豐富度不同。

2.3.1 酸菜樣品酵母菌微生物群落結構特征

表2 酸菜樣品酵母菌微生物群落結構特征

由表2可知，酸菜A，B，C的多樣性指數高于酸菜D，說明其他3種酸菜酵母菌種類較D豐富；酸菜A的均勻度比其他3種酸菜較低；酸菜A，B的豐富度比C，D較低，說明酸菜C，D中酵母菌含量較豐富。綜合比較酸菜C中的3項指標都較高，說明酸菜C中酵母菌豐富，且酵母菌種類豐富。

2.3.2 酸菜中酵母菌的聚類分析

圖4 酸菜中26S rDNA片段的DGGE條帶相似性聚類圖

發酵酸菜DGGE電泳圖譜DNA條帶的聚類分析結果見圖4，發酵全過程聚為兩大類：酸菜2與酸菜3聚為一類，即SB、SC聚為一類；酸菜1和酸菜4聚為一類，即SA、SD聚為一類，說明酸菜中酵母菌大致歸屬于兩大類群。

2.4 DGGE電泳分析及回收電泳帶的鑒定

為了研究酸菜中的微生物種類，實驗中回收亮度強的電泳帶，通過對回收序列進行測序，并與GenBank庫序列對比鑒定(見表3)。經鑒定，SA1、SA2、SB1、SB2、SC2、SC3、SD3分別與UnculturedKazachstania，Candidahumilis，Issatchenkiaoccidentalis，Pichiaoccidentalis，Issatchenkiaterricola，Saturnisporamendoncae，Saccharomycescerevisiae，相似度為87%、87%、99%、98%、89%、99%、99%。然后通過Mega 6軟件構建系統發育樹(見圖5)。

表3 酸菜酵母菌DGGE條帶序列結果

圖5 酸菜中酵母菌系統發育樹

由圖5可知，SA2與UnculturedKazachstania形成一個分支，可信度達到91%，SC2與Issatchenkiaterricola形成一個分支，可信度達51%，SB1、SB2與Pichiaoccidentalis形成一個分支，可信度達66%，SA1與SA2和UnculturedKazachstania形成一個分支，可信度達到100%，SC3與其下方6條序列形成一個分支，可信度達98%。

3 討論

酵母菌是酸菜中主要的微生物之一，因此也一直是主要的研究對象，酵母菌在酸菜的發酵工程中會影響其風味和質量。本實驗采用非培養的方法，通過PCR-DGGE等分子生物學技術對酸菜中酵母菌進行研究。之前也有很多關于發酵蔬菜中微生物的研究。烏日娜等的研究表明酸菜中細菌含量較高，而真菌較少。武俊瑞研究發現德巴利漢遜酵母(Debaryomyceshansenii)是真菌中的優勢種。有研究表明，在鹽漬青菜中分離出10種酵母菌，有4種優勢菌與假絲酵母屬(Candida)、德巴氏酵母屬(Debaryomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)的菌株相似[12,13]。本實驗則檢測出UnculturedKazachstania，Candidahumilis，Issatchenkiaoccidentalis，Pichiaoccidentalis，Issatchenkiaterricola，Saturnisporamendoncae，Saccharomycescerevisiae等酵母菌。有一些是幾種酸菜共有的，而有的是某種酸菜特有的。研究結果表明青菜酸菜中酵母菌多樣性高，且酵母菌群落穩定存在。

本次研究的優勢在于避免了傳統培養方法易污染、菌種不完全等缺陷。在意大利香腸[14]、韓國泡菜[15]等的研究基礎上，運用PCR-DGGE等技術研究泡菜中的酵母菌。本次研究也有一定的局限性，一些是實際操作中出現的問題，一些是技術上的問題。例如在操作中提取DNA、PCR、切膠等過程有可能造成DNA污染，或者由于操作的原因，使部分DNA分解，從而對目的菌種的種類和含量造成影響，這或許可以用來解釋為何DGGE條帶較少。不過這些非系統誤差可以通過優化實驗操作來完成。另外DGGE存在一定的局限性，它對經PCR擴增的DNA片段的長度、濃度等都有一定的要求，而且共遷移現象對測序來說存在困難。因此，本實驗雖然測出了酸菜中一部分酵母菌的種類、分布，但仍不完全，有待于進一步的研究。