外源添加酵母對黑豆醬油品質的影響

鐘小廷，呂杰，易謙武，劉迎濤，李可

(1.四川新希望味業(yè)有限公司，成都 610000；2.成都國釀食品股份有限公司，成都 610000；3.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610000)

醬油是我國的傳統(tǒng)調味品，生產(chǎn)歷史悠久。醬油風味的形成依賴于多種微生物及其產(chǎn)生的酶對蛋白質、淀粉、脂肪等物質的代謝和分解作用，生成氨基酸、小肽、糖分、甘油、有機酸及多種物質，從而形成醬油特有的風味和滋味特征[1,2]。

隨著對醬油發(fā)酵菌種、工藝和風味特性研究的深入，越來越多的研究表明，在醬油發(fā)酵過程中添加耐鹽酵母如魯氏酵母、球擬酵母等能夠有效解決傳統(tǒng)釀制醬油風味、香氣不足的問題，顯著提高醬油產(chǎn)品的風味品質[3-5]。 酵母在醬油發(fā)酵過程中不僅能夠產(chǎn)生醇類、醛類、羧酸類、酯類、酚類、呋喃類、吡嗪類等物質使醬油呈現(xiàn)獨特的香氣，而且乙醇等物質的生成還有一定的抑菌作用，利于醬油風味物質的釋放及醬油的保存等。也有研究表明，接種的魯氏酵母和球擬酵母對發(fā)酵過程中氨基酸、糖、有機酸等滋味物質的代謝也有影響，一方面，酵母能夠改變發(fā)酵群落結構，提高糖的利用率，促進蛋白質降解，提高醬油中關鍵鮮味物質谷氨酸含量[6]；另一方面，酵母自溶產(chǎn)生寡肽、氨基酸、核酸組分及糖類等呈味物質/前體物質[7]，也會影響醬油的風味品質。

目前國內(nèi)有關醬油發(fā)酵過程中酵母的研究主要集中在高產(chǎn)酒精酵母和耐鹽酵母菌的選育優(yōu)化、改善醬油風味及醬油風味成分分析等方面[8-10]，而酵母添加對醬油滋味物質的影響尚未見報道。本文通過比較實際生產(chǎn)中，高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝條件下外源添加魯氏酵母、球擬酵母對醬油品質以及關鍵滋味物質游離氨基酸組成等的影響，為闡明酵母添加對醬油滋味的影響及其物質基礎提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：米曲霉(Aspergillusoryzae)滬釀3.042、魯氏酵母AS2.180、球擬酵母AS2.202,成都國釀食品股份有限公司菌種保藏中心保藏。

原料：黑豆、小麥、食鹽，市售。

設備：酸度計、磁力攪拌器、722N型分光光度計、FA2004B型電子天平、202-2型電熱恒溫干燥箱、L-8900型氨基酸自動分析儀。

試劑：2.5 μmol/mL氨基酸標準品、緩沖液B1、B2、B3、B4、B5和茚三酮顯色液：日本日立公司；其余試劑(均為分析純)：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵工藝流程

發(fā)酵工藝流程見圖1。

圖1 發(fā)酵工藝流程圖(酵母添加組和非添加組各3個處理)

1.2.2 指標檢測

總酸、氨基酸態(tài)氮、食鹽、全氮、可溶性無鹽固形物參照GB 18186—2000進行測定；

酒精采用分光光度法測定[11]；

還原糖參照GB 5009.7—2016第一法進行測定；

氨基酸參照范霞等[12]的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin Pro 19.b分析常規(guī)指標的平均值及方差分析，顯著性分析采用獨立樣本t檢驗，氨基酸含量數(shù)據(jù)經(jīng)z-score標準化方法標準化后進行PCA分析，采用Heml 1.0做熱圖和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 外源添加酵母對醬油常規(guī)指標的影響

氯化鈉、氨基酸態(tài)氮、總氮、還原糖、總酸、乙醇含量及pH等是反映醬油品質優(yōu)劣的重要基礎指標，與發(fā)酵微生物有密切聯(lián)系。郭建等[13]的研究結果顯示不同代表性的魯氏酵母和球擬酵母在不同接種方式下對醬油的氨基酸態(tài)氮、總酸、乙醇以及還原糖等指標均無影響。宋茜研究認為，不同菌株對醬油的總氮、氨基酸態(tài)氮等有顯著影響[14]。李學偉等認為，低鹽稀態(tài)工藝條件下，醬油中添加酵母能夠明顯提高醬油的總酸、乙醇含量，氨基酸態(tài)氮含量降低，而對還原糖無顯著影響[15]。由此可知，酵母添加對醬油品質的影響也會隨著原料、酵母菌種、工藝條件的不同而不同。

圖2 酵母添加對醬油常規(guī)指標的影響

本文通過對比分析了高鹽稀態(tài)發(fā)酵條件下，魯氏酵母和球擬酵母對黑豆醬油常規(guī)理化指標的影響。由圖2可知，外源添加酵母對醬油的全氮、還原糖和乙醇含量影響較為顯著(P<0.05)，該研究結果與宋茜等的研究結果較為一致。而酵母添加對氨基酸態(tài)氮、總酸和pH值無顯著影響(P>0.05)。其中酵母添加組全氮略高于對照組，對照組還原糖含量是酵母添加組的1.67倍，而乙醇含量是酵母添加組的12.1%，這主要是由于酵母的添加增加了對還原糖物質的利用率，產(chǎn)生乙醇。研究表明，醬油中乙醇一方面作為代謝底物通過生物化學反應參與酸、酯等風味物質的形成，另一方面借助本身易揮發(fā)、是多種有機物的良好溶劑等物理特性，在揮發(fā)呈味的過程中可將醬油中一些有機成分帶出，使得乙醇含量高的醬油在氣味上也比較香醇，從而提升感官品質。此外，乙醇的產(chǎn)生還起到抑制雜菌、延長醬油保質期的作用，因此，本研究結果顯示酵母添加增加了黑豆醬油的品質。

2.2 外源添加酵母對醬油游離氨基酸的影響

醬油風味是由醬油氣味和味道組成的一個錯綜復雜的系統(tǒng)，氣味主要指揮發(fā)性物質被嗅覺所捕集到的信息，包括如乙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚等，味道主要指可溶性呈味物質對觸覺和痛覺所捕集到的信息，主要指氨基酸和核苷酸類物質如谷氨酸、IMP和GMP等。其中游離氨基酸含量高、呈味性多樣對醬油的品質起非常重要的決定作用，如甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等呈甜味；谷氨酸、組氨酸等呈酸味；谷氨酸鈉等呈鮮味；精氨酸、蛋氨酸等呈苦味。醬油中氨基酸還參與醬油的呈色反應，如酪氨酸、色氨酸等參與醬油黑色素的形成。因此，醬油游離氨基酸的種類和含量能夠反映醬油風味品質的優(yōu)劣及差異。

圖3 基于氨基酸組成的熱圖和聚類分析

通過對比不同工藝條件下黑豆醬油氨基酸含量可知，酵母添加組與對照組中游離氨基酸含量分別為(63.34±2.74)，(57.55±1.02) mg/100 g，酵母添加能夠提高游離氨基酸總含量，但無顯著影響(P>0.05)。酵母添加對黑豆醬油中谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸等有顯著影響(P<0.05)，酵母添加組谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸含量分別為(13.55±1.11)，(4.13±0.21)，(1.10±0.04)，(1.66±0.04)，(2.42±0.09) mg/100 g。對照組谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸含量分別為(9.62±0.46)，(3.61±0.19)，(0.97±0.12)，(1.80±0.03)，(1.99±0.04) mg/100 g。其中，谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、精氨酸含量顯著增高，組氨酸含量顯著降低。酵母添加對蘇氨酸有極顯著影響(P<0.01)，酵母添加組和對照組蘇氨酸含量分別為(3.34±0.04)，(3.09±0.03) mg/100 g。酵母添加對其他氨基酸含量影響較小(P>0.05)。以上研究結果表明，酵母添加能夠提高醬油中游離氨基酸的含量，且對決定醬油風味的重要游離氨基酸如谷氨酸、蘇氨酸等有顯著影響。

2.3 外源添加酵母對醬油游離氨基酸的影響

為了進一步明確酵母添加對游離氨基酸的影響以及對產(chǎn)品風味的影響，采用JMP13軟件對6個樣品的氨基酸組成進行PCA分析，結果見圖4和表1。

圖4 基于氨基酸組成的PCA分析

PCA分析結果顯示：第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為65.9%和21.4%，累計貢獻率為87.3%，說明前該兩個主成分能夠充分代表樣品的整體數(shù)據(jù)信息。由圖4可知，兩種工藝條件下6個樣品雖然沒有被顯著區(qū)分成兩類，區(qū)域有一定交叉，但也表現(xiàn)出差異性，添加酵母3個樣品聚集在PC1的正半軸，第一和第四象限，且較為接近，未添加酵母的聚集在PC1的負半軸，分布在第二和第三象限，且較為接近。說明添加酵母能夠影響氨基酸的組成。

表1 主成分分析各因子載荷矩陣

由表1可知，對主成分1貢獻率較大的主要有天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸，且這些組分含量與酵母添加呈正相關，說明酵母的添加能夠提高這些氨基酸的含量。

3 結論

隨著對醬油發(fā)酵研究的深入，外源添加耐鹽酵母對醬油品質的提升作用逐漸被認知。因此，以提升醬油風味品質的耐鹽酵母已廣泛應用于不同工藝醬油發(fā)酵生產(chǎn)中，并且圍繞提升醬油風味品質相關的酵母的菌種選育、耐鹽特性、發(fā)酵條件優(yōu)化等研究越來越多，在醬油品質提升方面取得了顯著成效。本研究分析比較了實際生產(chǎn)過程中，酵母添加對醬油常規(guī)指標和游離氨基酸含量的影響。結果顯示：酵母添加不僅能夠顯著性影響醬油中乙醇、總氮和還原糖含量，而且對醬油中游離氨基酸總量及氨基酸組成產(chǎn)生影響，該研究結果揭示了酵母添加對產(chǎn)品品質和味道特征方面的影響，對醬油實際生產(chǎn)及理論研究提供了理論參考。