氨基甲酸乙酯在醬油發(fā)酵過程中的形成機(jī)理研究

白曉娟，高榮錕

(1.晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 晉中 030801)

氨基甲酸乙酯是酒精飲料和發(fā)酵醬油中的一種常見物質(zhì)，其形成過程復(fù)雜。可通過對(duì)醬油中氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)的含量控制來間接控制其生成過程，利用生化方法可直接檢測(cè)醬油中氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)含量變化[1,2]。

本文研究氨基甲酸乙酯在醬油發(fā)酵過程中的形成機(jī)理，通過對(duì)醬油發(fā)酵不同階段的氨基甲酸乙酯含量和其前體物質(zhì)尿素、精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸的含量進(jìn)行檢測(cè)，建立氨基甲酸乙酯與其前體物質(zhì)之間的變化關(guān)系，來獲取醬油中氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理。

1 氨基甲酸乙酯介紹

氨基甲酸乙酯是一種酯類物質(zhì)，并含有大量的氨基酸，是一種無色晶體，無臭味，易溶解于水和乙醇中[3]。氨基甲酸乙酯在醫(yī)藥合成過程中具有廣泛的用途，同時(shí)也是一種麻醉劑。氨基甲酸乙酯可通過粉塵或者飲食過程進(jìn)入人體，是淋巴癌或肺癌的主要致癌點(diǎn)[4]。氨基甲酸乙酯可作為農(nóng)藥的中間體，用于化工領(lǐng)域，同時(shí)可用于麻醉劑的生產(chǎn)過程中。

在醬油發(fā)酵過程中隨著氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)的不斷變化，而產(chǎn)生不同特性的氨基甲酸乙酯[5]。氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)主要包含尿素、精氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸，前體物質(zhì)在醬油釀造過程中的變化規(guī)律具有一定的相關(guān)性[6]。

2 氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)檢測(cè)

在醬油發(fā)酵過程中，從第10天開始，每隔10 d提取醬油發(fā)酵樣品，直至整個(gè)醬油發(fā)酵周期完成。對(duì)提取的醬油發(fā)酵樣品采用8層紗布進(jìn)行過濾，獲得液態(tài)醬汁，分別取10 g后進(jìn)行固相萃取及標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)處理[7,8]。在兩種檢測(cè)試驗(yàn)條件下分別檢測(cè)其中的氨基甲酸乙酯、尿素、精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量，其中一組添加酵母，一組不添加酵母，每種成分的檢測(cè)進(jìn)行3組試驗(yàn)檢測(cè)，取其平均值。

本文所用的發(fā)酵醬油原材料為豆粕和麩皮，所選酵母為魯氏酵母，酵母培養(yǎng)基中添加0.3 g酵母浸粉，0.6 g葡萄糖，0.6 g蛋白胨以及少量的水，并在115 ℃條件下進(jìn)行滅菌。

在醬汁中，尿素可被酵母吸收，形成尿素的循環(huán)代謝。當(dāng)醬汁中的精氨酸含量抑制了酵母細(xì)胞的代謝時(shí)，尿素?zé)o法進(jìn)行有效的代謝循環(huán)，此時(shí)酵母細(xì)胞中的尿素排入醬汁[9]。尿素?zé)o臭無味，可溶于酒精和水中，是醬油發(fā)酵過程中微生物的主要氮物質(zhì)來源。對(duì)于尿素的檢測(cè)主要通過測(cè)量有色物質(zhì)溶液的顏色來進(jìn)行組分檢測(cè)，將光度計(jì)的檢測(cè)結(jié)果換算成尿素含量。尿素的檢測(cè)波長(zhǎng)為422 nm，測(cè)量范圍可達(dá)到8.8～107 mg/L。醬汁中尿素含量變化曲線見圖1。

圖1 尿素含量變化曲線

由圖1可知，在醬油發(fā)酵過程中，醬汁中的尿素整體含量先下降后上升。在發(fā)酵初期，尿素含量不斷降低，第30天時(shí)，在不添加酵母的醬汁中尿素含量為18 mg/L，在添加酵母的醬汁中尿素含量為8 mg/L。從第30天開始，酵母自身開始產(chǎn)生尿素，因此醬汁中的尿素含量不斷上升，不添加酵母的醬汁中尿素含量明顯高于添加酵母的醬汁中尿素含量。

隨著醬油發(fā)酵時(shí)間的推移，醬汁中的微生物將大分子蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，產(chǎn)生精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸，該類氨基酸是氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)[10]。醬汁中精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量的變化規(guī)律決定了醬汁中氨基甲酸乙酯的含量。

精氨酸可在堿性溶液中發(fā)生反應(yīng)，生成次氯酸鹽等橙紅色物質(zhì)，進(jìn)一步通過比色法來進(jìn)行精氨酸含量檢測(cè)。醬汁中精氨酸含量變化曲線見圖2。

圖2 精氨酸含量變化曲線

由圖2可知，在醬油發(fā)酵過程中，醬汁中的精氨酸整體含量先上升后下降，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷推移，醬汁中的精氨酸含量變化逐漸平緩。不添加酵母的醬汁中精氨酸在第30天達(dá)到最大值3300 mg/L，添加酵母的醬汁中精氨酸在第70天達(dá)到最大值2700 mg/L。在發(fā)酵初期，醬汁中微生物不斷分解蛋白質(zhì)，使精氨酸含量上升，隨著醬油原料物質(zhì)中蛋白質(zhì)的逐漸減少和微生物對(duì)精氨酸進(jìn)行分解，精氨酸含量逐漸降低，并最終趨于平緩。發(fā)酵初期，因酵母對(duì)精氨酸的代謝作用，添加酵母的醬汁中精氨酸含量低于未添加酵母的醬汁中精氨酸含量。發(fā)酵后期，添加酵母的醬汁中精氨酸減少速度低于未添加酵母的醬汁中精氨酸減少速度。

瓜氨酸可在酸性條件下生成丁二酮，并在強(qiáng)酸環(huán)境中發(fā)生縮合，形成紅色的化合物。瓜氨酸含量變化曲線見圖3。

圖3 瓜氨酸含量變化曲線

由圖3可知，在未添加酵母的醬汁中，瓜氨酸含量先上升后下降再上升，并在發(fā)酵后期達(dá)到近似平緩狀態(tài)，在發(fā)酵第30天時(shí)，瓜氨酸達(dá)到最大值3750 mg/L。在添加酵母的醬汁中，瓜氨酸含量逐漸上升，在發(fā)酵第60天時(shí)達(dá)到平緩狀態(tài)。由此說明酵母抑制了瓜氨酸的增長(zhǎng)，使瓜氨酸變化規(guī)律為逐漸上升并最終處于平緩狀態(tài)。

鳥氨酸可在茚三酮混合性酸性溶液的顯色作用下，發(fā)生水浴反應(yīng)，并在510 nm波長(zhǎng)照射下，進(jìn)行鳥氨酸測(cè)定。鳥氨酸含量變化曲線見圖4。

圖4 鳥氨酸含量變化曲線

由圖4可知，醬汁中鳥氨酸含量逐漸上升后下降，并最終基本處于平緩狀態(tài)，鳥氨酸含量在第50天時(shí)達(dá)到最大值，且添加酵母的醬汁中鳥氨酸含量高于未添加酵母的醬汁中鳥氨酸含量，其主要原因是在醬油發(fā)酵過程中，酵母可以分解醬汁中的蛋白物質(zhì)，產(chǎn)生鳥氨酸。

3 氨基甲酸乙酯與尿素及氨基酸關(guān)系

在醬油生產(chǎn)過程中，對(duì)氨基甲酸乙酯的控制是通過對(duì)其前體物質(zhì)的控制來研究的，各物質(zhì)之間存在相互轉(zhuǎn)化過程，并共同影響醬汁中氨基甲酸乙酯的形成。為此在未添加酵母的條件下，建立醬汁中氨基甲酸乙酯與其前體物質(zhì)之間的變化關(guān)系。氨基甲酸乙酯不易揮發(fā)，溶解度較小，在較高的壓力下形成蒸汽。氨基甲酸乙酯可在展開溶劑的條件下，利用362 nm波長(zhǎng)的紫外光進(jìn)行照射，形成藍(lán)紫色的熒光斑點(diǎn)，對(duì)醬汁中的氨基甲酸乙酯進(jìn)行半定量分析。

為研究醬油中氨基甲酸乙酯與尿素之間的關(guān)系，本文將醬汁中的尿素與氨基甲酸乙酯含量變化過程進(jìn)行對(duì)比。氨基甲酸乙酯與尿素之間的關(guān)系曲線見圖5。

由圖5可知，隨著醬油發(fā)酵過程的進(jìn)行，醬汁中氨基甲酸乙酯含量與尿素含量都出現(xiàn)上升狀態(tài)，且變化趨勢(shì)基本相同。在醬油發(fā)酵的開始階段，尿素作為發(fā)酵過程中的氮源，隨著微生物的代謝，尿素外排，醬汁中的尿素含量發(fā)生變化。醬汁中的氨基甲酸乙酯與尿素之間存在一定的關(guān)系，且尿素含量越高，氨基甲酸乙酯的含量越高。

為研究醬油中氨基甲酸乙酯與氨基酸之間的關(guān)系，本文分別將醬汁中的精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸與氨基甲酸乙酯含量變化過程進(jìn)行對(duì)比。氨基甲酸乙酯與精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸之間的關(guān)系曲線見圖6。

圖6 氨基甲酸乙酯與氨基酸的關(guān)系

由圖6可知，隨著醬油發(fā)酵過程的進(jìn)行，氨基甲酸乙酯含量逐步上升；精氨酸含量先上升后下降；鳥氨酸含量逐步上升，并最終處于平穩(wěn)狀態(tài)；瓜氨酸含量逐步上升，并最終處于平穩(wěn)狀態(tài)。在醬油的發(fā)酵過程中，精氨酸逐步被生物分解利用，含量逐步降低，根據(jù)醬汁中氨基酸的組合排布形式，初步預(yù)測(cè)精氨酸代謝途徑，隨著精氨酸的分解，瓜氨酸和鳥氨酸含量逐步上升，表明瓜氨酸存在其他的代謝過程。因?yàn)閹追N氨基酸之間存在相互轉(zhuǎn)化，因此氨基酸之間的相對(duì)含量共同影響氨基甲酸乙酯的形成過程。

4 結(jié)論

尿素、精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸作為醬油氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)，其變化規(guī)律可間接反映氨基甲酸乙酯的形成規(guī)律。在醬油發(fā)酵初期，尿素含量快速降低，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，尿素含量逐步上升，其中氨基甲酸乙酯的含量也逐步上升，表明醬汁中尿素促進(jìn)了氨基甲酸乙酯的形成。在發(fā)酵初期，精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量逐步升高，發(fā)酵中前期下降，并開始逐步上升，最終處于平穩(wěn)狀態(tài)，氨基甲酸乙酯含量逐步上升，在發(fā)酵后期基本處于平穩(wěn)狀態(tài)。表明幾種氨基酸前體物質(zhì)含量與氨基甲酸乙酯含量之間的變化趨勢(shì)基本相同，隨著發(fā)酵過程中微生物的作用，相互關(guān)系之間存在一定的波動(dòng)性。