氧化苦參堿對哮喘小鼠肺組織MUC5AC表達的影響

蘭露莎 趙兵兵 陳強 楊紅宇

摘要：目的：探討氧化苦參堿對哮喘小鼠肺組織的MUC5AC和TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子表達的影響。方法：用Al（OH）3和卵清白蛋白誘發BALB/c小鼠過敏性哮喘，哮喘模型建立后，予氧化苦參堿或地塞米松進行治療，分別在治療后第5、15天處死部分小鼠，留存血清、支氣管肺泡灌洗液和肺組織進行檢測。采用ELISA法檢測血清和支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子的含量，qRT-PCR、免疫組化法、免疫印跡法檢測肺組織MUC5AC的mRNA和蛋白質表達情況。結果：在治療后第5天和第15天時，氧化苦參堿治療組或氧化苦參堿和地塞米松聯合治療組血清或支氣管肺泡灌洗液的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13含量均較哮喘組降低（P<0.01或P<0.05）;哮喘組肺組織TLR4的mRNA和蛋白表達與正常組無差異，MUC5AC的mRNA和蛋白表達較正常組顯著增高，氧化苦參堿治療組或氧化苦參堿和地塞米松聯合治療組可上調TLR4的mRNA和蛋白表達，下調MUC5AC的mRNA和蛋白表達，以氧化苦參堿和地塞米松聯合治療組顯著（P<0.01）。結論?氧化苦參堿可通過上調TLR4的表達調節小鼠的免疫應答，下調TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子的表達或含量減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應，通過下調MUC5AC的表達控制哮喘小鼠氣道粘液過度分泌，且與地塞米松聯合使用該作用更顯著。

關鍵詞：氧化苦參堿;哮喘;MUC5AC;TLR4;小鼠

前言

氧化苦參堿（Oxymatrine， OMT）是從豆科屬植物苦參或平科植物廣豆根中分離出來的生物堿， 又名苦參素。它的化學分子式為C15H24N2O2，具有四環的喹嗪啶類結構， ， ，易溶于水，分子量為264，無色結晶。由于氧化苦參堿的廣泛臨床應用，對其藥理作用及作用機制的研究也越來越引起相關醫藥學者的極大興趣。近年來，大量研究表明氧化苦參堿具有利尿、抗病原體、免疫作用等廣泛的藥理作用[1， 2，]，顯現出具有新用途開發的意義。近年研究顯示，氧化苦參堿在哮喘的治療上有顯著療效，能抑制氣道炎癥及抗氣道高反應性等作用，但機制不詳。

本研究通過建立過敏性哮喘小鼠模型，小鼠氣道粘蛋白MUC5AC基因和蛋白表達情況的觀察，深入探討OMT對哮喘模型小鼠哮喘的干預機制，為民族藥開拓新的藥理作用。

1 材料

1.1 BALB/c小鼠，雌性，4-6周齡，SPF級（合格證號SYXK（黔）2012-001），購自貴州省實驗動物工程中心，生產許可證號SCXK（黔）2012-001。

1.2 試劑和試劑盒：2% Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant，購自InvivoGen公司（Lot #5113）， 卵清白蛋白（Albumin from chicken egg white， OVA），購自sigma公司（批號1001988500），注射用地塞米松磷酸鈉，購自馬鞍山豐原制藥有限公司（批號150512-1）。氧化苦參堿（純度99.0%），購自中國藥品生物檢定所，為國家藥品標準物質，批號110780-201007。小鼠TNF-α（JEM-12）、IL-4（JEM-04）和 IL-5（JEM-03）定量分析酶聯免疫檢測試劑盒，購自安徽巧伊生物科技有限公司小鼠IL-13定量分析酶聯免疫檢測試劑盒，購自聯科生物科技有限公司（221341235）。動物組織總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司（#03901），Prime ScriptTM RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，購自TAKARA BIO INC.。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物有限公司。兔抗MUC5AC多克隆抗體、兔抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG 抗體購自博士德生物工程有限公司。GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒，基因科技（上海）有限公司。PVDF購自美國Millipore公司，PAGE電泳試劑、ECL 發光液購自美國BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 哮喘小鼠模型的建立及實驗分組?根據文獻的方法并予以改進建立哮喘模型：第1、8、15天腹腔注射OVA及氫氧化鋁凝膠混合液0.2ml（內含OVA60?g及2.25mg氫氧化鋁凝膠）致敏;第21天開始用5%OVA溶液8ml行超聲霧化，每次30min，連續霧化5天進行激發。正常對照組用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化。54只SPF級BALB/c小鼠，雌性，4-6周齡，隨機分為6組，每組9只：①CON組，用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化，不給藥;②AST組，按上述方法進行致敏和激發，不給藥;③TRE組，按上述方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min腹腔注射地塞米松（0.5mg/kg）;④OMT-H組，按上述方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min腹腔注射OMT（25mg/kg/D）;⑤OMT-M組，按上述方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min腹腔注射OMT（12.5mg/kg/D）;⑥OMT-L組，按上述方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min腹腔注射OMT（6.25mg/kg/D）。于治療后第5天處死小鼠3只/組，同時①摘眼球取血并制備血清凍存于-20℃;②從氣管注射無菌NS 0.5ml入肺，抽吸3次后將抽出液體即支氣管肺泡灌洗液（BALF）凍存于-20℃;③分別稱小鼠體重和肺組織重量并記錄;④取右下肺葉置于4%多聚甲醛中固定;⑤余下肺組織凍存于-80℃。各組小鼠不再激發，隔天給予相應藥物1次，持續5次后，處死小鼠，留存標本及相應檢查同前。

2.2血清及BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量檢測?根據試劑盒說明書方法進行，根據檢測結果繪制標準曲線，計算各樣品中指標因子的含量，制作柱形圖。

2.3肺組織MUC5AC mRNA表達情況的檢測?采用real time PCR法， MUC5AC上游引物5- ACACCGCTCTGATGTTCCTCACC-3，下游引物5- ATGTCCTGGGTTGAAGGCTCGT-3;GAPDH上游引物5- CATGGCCTTCCGTGTTCCTA -3，下游引物5- GCGGCACGTCAGATCCA -3。每個樣品各取約20mg肺組織，參照說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以2μL cDNA為模板行real time PCR檢測。反應條件：預變性（95℃，30 s），PCR反應（Repeat 40，95℃，5 s;52℃，30s）。確定Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，記錄各組的Ct值。分別以GDPDH為內參，計算各組樣本中MUC5AC基因的表達量，并對表達量的比值（2-△△Ct）進行分析。

2.4免疫組織化學法檢測肺組織MUC5AC蛋白的表達?常規方法制備肺組織石蠟切片，采用免疫組化SP法進行操作。陽性部位成棕褐色。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行圖像分析，取平均積分光密度值表示目的蛋白的表達水平。

2.5免疫印跡法檢測肺組織MUC5AC蛋白的表達?試劑盒方法提取小鼠肺組織的總蛋白質和細胞核蛋白質，BCA法定量蛋白質，常規方法行SDS-PAGE電泳、轉膜、雜交、顯影，用QuantityOne軟件分析曝光條帶，各蛋白條帶的灰度值與相應的GAPDH條帶灰度值的比值進行半定量分析。

2.6 統計學方法?各組所得計量數據采用均數±標準差（）表示，用SPSS19.0軟件處理數據，兩組間均數比較用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05，p<0.05有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量?在治療后第5天和第15天時，AST組血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均顯著高于正常組，TRE組和OMT-H組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量顯著下調（見圖1，P<0.05）。

3.2 小鼠BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量?在治療后第5天和第15天時，MOD組BALF中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均較正常組明顯增高，TRE組和OMT-H和M組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量下調（P<0.05）（見圖2）。

3.3 小鼠肺組織MUC5AC mRNA的表達?qRT-PCR的結果顯示，哮喘小鼠肺組織MUC5AC基因在治療第5天或15天時較正常組均明顯增高，而治療TRE組和OMT各組可下調MUC5AC基因的表達（見圖3）。

3.4 小鼠肺組織MUC5AC蛋白的表達?免疫組織化學結果顯示，MUC5AC蛋白主要表達在支氣管上皮細胞，存在于胞漿內，陽性染色表現為棕褐色顆粒。治療5天或15天后，哮喘小鼠肺組織MUC5AC 蛋白表達明顯高于正常組，而TRE組和OMT各組肺組織MUC5AC蛋白的表達較AST組減少（見圖4A）。免疫印跡結果顯示，哮喘小鼠肺組織MUC5AC 蛋白表達明顯高于正常組，而TRE組和OMT各組肺組織MUC5AC蛋白的表達下調（P<0.05）（見圖4B）。

4討論

苦參當中含有大量的生物堿，其中含量最高的是苦參堿和氧化苦參堿。國內外大量的研究表明，苦參堿類化合物有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗病毒、免疫抑制、保肝利膽、抗寄生蟲等多方面的藥理作用[1，2]。氧化苦參堿因其具有特殊的氧結構，從而改變了藥物分子的極性，也因此具有了比苦參堿更獨特的作用機理和療效[22]。氧化苦參堿的抗炎作用是其治療哮喘的重要藥理機制，它能起到抗炎、平喘的作用[3]。

近年來，隨著對OMT研究的不斷深入，其在呼吸系統方面作用也逐漸被人們重視[21]。支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球范圍內威脅公眾健康的常見的慢性呼吸道炎癥性疾病，全世界約有3億人患哮喘[4，5]。炎癥、重塑及粘液高分泌是支氣管哮喘的重要病理表現[23]。Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）自1997年發現至今，已發現十余種，其中TLR4在哮喘氣道慢性炎癥的發生和維持中發揮重要作用，參與了哮喘炎癥與氣道重塑的病理過程和免疫應答[3]。TLR4通過跨膜結構將病原相關分子刺激信號轉導入細胞內，產生復雜的級聯信號反應，最終誘導細胞因子合成與釋放，介導腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素（IL）等炎性介質基因的表達，引起相應炎性介質的合成和釋放[6，7]。氣道粘液是一種具有粘附性和彈性的粘性膠，其中主要發揮功能的是粘蛋白（mucin，MUC），由氣道杯狀細胞分泌產生的粘蛋白MUC5AC表達和分泌增多被認為是氣道粘液高分泌的分子學基礎，反映了氣道粘液分泌的情況[8，9，10]。

氧化苦參堿的藥理作用廣泛，初步顯現出多種有新藥開發意義的藥理作用，但系統研究不夠，在此方面的產品報道也較少，大多停留在研究階段，希望能加強氧化苦參堿在醫療應用方面的產品研制和開發[11，12]。同時以氧化苦參堿的經典論述為指導，結合現代的研究方法，組織生命科學、化學、藥學等多學科協作，展開有效物質基礎、作用特點、作用機理等的綜合研究，并將動物實驗與臨床實驗相結合，動物實驗能闡明藥物的作用機制，同時也是進行臨床實驗的基礎[13，14，17]。臨床實驗排除了安慰劑效應、疾病自限、向均數回歸等現象的干擾，是檢驗氧化苦參堿臨床療效的最終手段[16，19]。若療效可靠，則臨床使用量迅速增長，故進一步加強對氧化苦參堿的研究具有重要的社會意義和巨大的經濟效益[15，18，20]。

課題組前期的研究證實氧化苦參堿具有治療哮喘的作用，但具體機制不清。因此本文通過對實驗小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中多種炎性介質的檢測、肺組織中TLR4基因和蛋白表達情況的觀察，以及粘蛋白MUC5AC基因和蛋白表達情況的觀察，探討氧化苦參堿對哮喘模型小鼠哮喘的干預機制，為民族藥開拓新的藥理作用。

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基金項目：貴州省科技廳省科技合作計劃項目（黔科合LH字[2016]7369）

貴州省國家級、省級創新創業訓練計劃項目（DC 201710660036）

作者簡介：蘭露莎（1984-），女，碩士研究生，實驗師，貴州醫科大學實驗動物中心.

通訊作者：楊紅宇（1970-），男，高級實驗師.