豬MMP20基因變異篩選及其與母豬繁殖性狀的關聯分析

吳俊靜，董斌科，喬 木，梅書棋，彭先文

（動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室/湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430064）

豬的繁殖性狀是直接關系到養豬業的經濟收益的重要經濟性狀，尤其是豬產仔數性狀，提高母豬產仔數對提高養豬業的總體經濟效益意義重大。然而，母豬繁殖性狀多為低遺傳力的復合性狀，很難用常規育種技術進行遺傳改良，所以尋找控制母豬繁殖性狀的關鍵分子遺傳標記，應用于該性狀的分子輔助育種，對提高母豬繁殖性能具有重要意義。

基質金屬蛋白酶-20（MMP20，Matrix Metallopeptidase 20）是基質金屬蛋白酶家族中的一員，主要與牙齒發育密切相關，在降解釉原蛋白方面發揮重要作用。MMP20基因的突變可導致釉質發育不良［1］，與齲齒有密切關系［2］。另有文獻報道，MMP20基因缺失與神經母細胞瘤有關［3］。以上主要是在人和鼠中的研究結果，有關豬MMP20基因的研究甚少，有關MMP20基因對豬繁殖性能的影響還未見報道。湖北省農業科學院豬育種團隊通過全基因組關聯分析技術初步篩選發現MMP20與豬繁殖性狀相關，為此，本研究擴增了豬MMP20基因序列，利用該序列進行了多態性變異位點的篩選鑒定及與母豬繁殖性狀的關聯分析研究，以期獲得與母豬繁殖性狀相關的新分子標記。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

采集了15頭梅山豬（英山縣綠源養豬專業合作社）、255頭大白豬（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所原種豬場）母豬血樣，并收集大白豬群在2011—2017年期間的繁殖性狀記錄，主要包括總產仔數（TNB，total number born）、產活仔數（NBA，number born alive）、出生窩重（LW，litter weight）、出生個體重（BW，birth weight of piglet）、21日 齡 活 仔 數（NAd21，number alive in 21 days of born）、21日齡窩重（LWd21，litter weight in 21 days of born）。

基因組DNA采用北京百泰克生物技術有限公司生產的基因組DNA試劑盒（按該試劑盒說明書進行操作）提取。

1.2 豬MMP20基因多態性檢測

根據豬MMP20基因的基因組序列（GenBank登陸號：NC_010451）設計引物：上游引物：5′-TCTTACAGTAGACCTTGTGCCA-3′，下游引物：5′-TGGCTTGGGACGTTGAACCT-3′。在梅山豬和大白豬中，分別取15頭豬的DNA樣本混合，進行PCR擴增，PCR反應體系50μL，體系中各組分的濃度為100 ng模板DNA、10×buffer（含Mg2+）4μL、上述上下游引物各0.5μmol/L、2.5μmol/L dNTPs、1UTaqDNA聚合酶。PCR的運行程序為：95℃預熱2 min；94℃變性20 s，62～57℃退火40 s（每個循環降低0.5℃），72℃延伸60 s，共11個循環；94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，采用Gel Extraction Kit試劑盒進行純化。純化產物直接送到北京奧科公司進行DNA測序，對比篩選基因變異位點。

1.3 基因分型

利用上述引物，采用上述PCR產物直接測序法在大白豬群中進行基因分型。

1.4 統計分析

采用SAS 9.0軟件的GLM模型進行標記的關聯分析。所采用模型為：Yij k=μ+Pi+S j+Gk+ei jk，其中Yijk為性狀表型值，μ為總體均值，Pi為胎次效應，S j為季節效應，Gk為基因型效應，eijk為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 豬MMP20基因多態性檢測結果

通過對梅山豬和大白豬兩個DNA混合樣本池進行MMP20基因片段擴增測序，在兩個品種豬中均檢測到豬MMP20基因第3內含子中2個堿基突變位點，即位于該基因序列第14334 bp處的C＞G堿基突變（g.14334 C＞G）和第14369 bp的T堿基突變（g.14369 C＞T），如圖1所示。

圖1 豬MMP20基因第3內含子2個堿基突變位點的測序圖譜

2.2 關聯分析

在255頭大白豬群及其共計868條胎次繁殖性狀記錄中分析了豬MMP20基因2個突變位點（g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T）基因型與母豬產仔數性狀的相關關系。結果發現在大白豬群體中g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T兩個位點完全連鎖，群體中只存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3種基因型。將3種基因型與母豬繁殖性狀進行關聯分析，結果發現不同基因型的母豬產仔數、產活仔數、出生個體均重及21日齡窩重性狀均差異極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）（表1）。GG/CC基因型個體產仔數、產活仔數與21日齡活仔數均顯著低于GC/CT和CC/TT基因型個體（P＜0.05），產仔數存在GG/CC＜GC/CT＜CC/TT的關系。雖然，GG/CC基因型個體的出生個體重顯著高于GC/CT和CC/TT基因型個體（P＜0.05），但出生窩重顯著低于GC/CT和CC/TT基因型個體（P＜0.05）。

表1 豬MMP20基因突變與母豬繁殖性狀的關聯分析統計結果

3 小結與討論

本研究鑒定獲得了豬MMP20基因第3內含子中的2個單堿基突變位點g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T。這兩個突變位點在基因組上間距35 bp，在本試驗檢測的大白豬群中完全連鎖，僅存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3種基因型。經與母豬繁殖性狀的關聯分析發現，這兩個突變位點顯著影響母豬總產仔數、產活仔數、21日齡活仔數、出生個體重和出生窩重等繁殖性狀（P＜0.05），并且產仔數性狀存在GG/CC＜GC/CT＜CC/TT的關系。因此，MMP20基因第14334 bp處的C等位基因以及第14369 bp處的T等位基因是產仔數的優勢等位基因，在育種中應予以保留攜帶這些優勢等位基因的個體，有利于提高群體的產仔數性狀。

MMP20是新發現的一種基質金屬蛋白酶（MMPs），具有鈣離子結合、金屬內肽酶活化等功能，參與新陳代謝、蛋白水解等過程。目前該基因的研究多集中于口腔疾病方面，與牙釉質疾病、食管癌、喉癌、舌癌相關［4］。近年來也有研究表明MMP20蛋白與子宮內膜癌及預后不良有關［5］；該基因的突變與卵巢癌發病風險顯著相關［6］。但未見報道此基因與繁殖性能相關，但是MMPs在月經周期、排卵、胎盤形成、產后子宮恢復等過程中起重要作用［7］。郭敏等［8］發現子宮內膜異位癥患者腹腔液中MMPs水平升高，可能與盆腔粘連的發生及嚴重程度相關；高揚等［9］也發現MMPs與子宮內膜異位癥合并不孕癥有關；王卉菲等［10］報道MMPs蛋白參與影響胎盤淺著床過程；MMPs與雙胎早產也有密切的關系［11］。有關豬MMP20的研究極少，本研究發現了豬MMP20基因的2個遺傳突變位點顯著影響母豬繁殖性狀，然而其具體作用機制還需要做更深入的基因功能分析與研究。