厚樸酚治療重癥急性胰腺炎大鼠模型并發急性肺損傷的作用機制

王 燕， 齊文杰， 曾亞薇， 谷培云， 苗 彬

1 首都醫科大學附屬北京友誼醫院 感染內科， 北京 100050； 2 首都醫科大學 研究生院， 北京 100069

重癥急性胰腺炎(SAP)相關性肺損傷是SAP早期最常見、最嚴重的并發癥,急性胰腺炎(AP)患者約1/3伴發急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征, 1周內死亡AP患者大約60%伴有急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征[1]，而SAP死亡病例中有50%發生重度肺損傷[2]。研究[3]發現，引流胸導管淋巴液能夠明顯減少SAP病程中炎癥因子釋放。臨床上通過大量補液以改善腸道缺血以及在疾病得到有效控制后及早進食以促進胃腸動力恢復，從而達到“功能性阻斷”腸淋巴循環治療AP。厚樸酚具有抑制炎癥反應、緩解炎性疼痛等作用[4]。研究[5]發現，厚樸酚能夠通過拮抗氧化應激和調控Cajal細胞改善膿毒癥所致胃腸運動障礙。本實驗從厚樸酚功能性阻斷腸淋巴循環方面研究厚樸酚對 SAP并發急性肺損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 主要試劑:3.75%牛磺膽酸鈉(美國Sigma公司)、戊巴比妥鈉(德國默克公司)、厚樸酚(北京環亞泰克生物醫學技術有限公司)、DMSO(北京環亞泰克生物醫學技術有限公司)、蛋白裂解液( 北京普利萊公司)、蛋白酶抑制劑( 北京普利萊公司)等。主要儀器：DHG9070B電熱鼓風干燥箱(上海安亭科學儀器有限公司)、Sigma3K-18高速低溫離心機(美國Sigma公司)、QL-901旋渦混合器(江蘇其林貝爾儀器制造有限公司)、XQ-04750-50勻漿機(美國Biospec公司)、BX43型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)等。

1.2 動物模型構建與分組 雄性健康SD大鼠30只，體質量(300±50)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號:SCXK(京)2016-0006，使用許可證號：SYXK(京)2017-0019)]。大鼠適應性飼養1周，術前12 h禁食，正常飲水。隨機分為假手術組、SAP組和厚樸酚治療組，每組各10只。假手術組為正常大鼠開腹翻動胰腺后直接縫合；SAP組采用逆行胰膽管注射3.75%的牛磺膽酸鈉建立SAP大鼠模型；厚樸酚治療組：經陰莖靜脈注射厚樸酚0.2 mg/kg，15 min后，采用逆行胰膽管注射3.75%的牛磺膽酸鈉建立SAP大鼠模型。SAP組及厚樸酚治療組于造模后4 h經腸系膜淋巴管引流淋巴液、腹主靜脈采血，后處死大鼠留取肺組織、腸組織，并保存于-80 ℃冰箱。假手術組同樣時間點用上述方法留取腸系膜淋巴液、靜脈血、肺和腸組織。

1.3 標本采集 自腸系膜淋巴管進行淋巴液引流至EP管中，置于-80 ℃保存。打開腹腔使用靜脈采血針穿刺下腔靜脈抽取血液4～5 ml，取上部血清，-20 ℃條件下保存，用于后期ELISA檢測。取冷凍保存腸、肺組織約100 mg，每1 mg組織加入10 μl組織裂解液，置于冰上，進行充分勻漿。均漿液轉移至1.5 ml無菌EP管中，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液至另一1.5 ml無菌EP管中，備用于ELISA和Western Blot檢測。

1.4 檢測指標 ELISA檢查肺、腸組織內二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(DLA)、IL-1β、IL-8、IL-10、TNFα、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、晚期糖基化終產物受體(RAGE)水平變化。Westrrn Blot方法檢測淋巴液中Toll樣受體4(TLR4)水平。對肺臟、胰腺及回腸進行組織學觀察及病理評分[3,6]。造模后4 h，分別稱取0.1 g肺組織放入培養皿中，將組織放入60 ℃干燥箱內72 h，重新稱量組織干重。

1.5 倫理學審查 本實驗方案經由首都醫科大學附屬北京友誼醫院實驗動物倫理委員會審批，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 病理檢測結果

2.1.1 各組胰腺組織病理學改變 大鼠胰腺大體觀察以及鏡下觀察均無明顯異常；SAP 組大鼠胰腺大體觀察時可見出血、壞死部分，同時腹腔內有大量血性積液(圖1)。鏡下觀察：SAP組大鼠胰腺組織小葉間有明顯水腫以及較大量的炎性細胞浸潤，有出血及胰腺小葉結構破壞的情況，同時腺泡細胞有明顯壞死(圖2)，證實SAP大鼠造模成功。

2.1.2 各組肺組織病理學改變 鏡下觀察(圖3)：假手術組肺組織病理無明顯改變，病理評分0.34±0.02；SAP組肺間質可見充血、水腫、炎細胞浸潤、出血，病理評分2.67±0.52；厚樸酚治療組肺組織輕度出血和炎細胞浸潤，病變程度較SAP組輕，病理評分1.50±0.55。3組間病理評分比較差異均有統計學意義(F=29.5，P<0.001)，進一步兩兩比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。根據大鼠肺組織病理可見SAP肺損傷模型制備成功。

2.1.3 各組腸組織病理學改變 假手術組腸組織大體形態未見明顯異常；SAP組腸管擴張、充血、水腫，可見腸系膜皂化斑；厚樸酚治療組大鼠腸管擴張、充血、水腫的程度減輕，腸系膜皂化斑范圍減少(圖4)。

鏡下觀察(圖5)：假手術組未見明顯異常，病理評分0.33±0.02。SAP組可見腸間質水腫、充血、大量炎性細胞浸潤，腸絨毛水腫增粗、高度縮短，絨毛上皮剝脫、上皮頂端片狀壞死及脫落，杯狀細胞排列紊亂、細胞數量減少；黏膜變薄，腺體排列稀疏，且數量減少，病理評分4.83±0.41。厚樸酚治療組較SAP組病理損傷均有不同程度減輕，病理評分3.50±0.55。3組間比較差異有統計學意義(F=131.136,P<0.001)，進一步兩兩比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

2.2 各指標ELISA檢測結果

2.2.1 血清中各指標檢測結果 3 組間IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)，進一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組血清中IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05);假手術組血清中IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表1)。

2.2.2 淋巴液中各指標檢測結果 3組間IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)，進一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組大鼠淋巴液中IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05);假手術組IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表2)。

2.2.3 腸組織中各指標檢測結果 3組間IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平差異均具有統計學意義(P值均<0.05)，進一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE均低于SAP組(P值均<0.05);假手術組IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表3)。

2.2.4 肺組織中各指標檢測結果 3組間IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)，進一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組大鼠肺組織中IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE均低于SAP組(P值均<0.05);假手術組IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表4)。

表1 2組大鼠血清中相關成分比較

表2 2組大鼠淋巴液中相關成分比較

表3 2組大鼠腸組織中相關成分比較

表4 2組大鼠肺組織中相關成分比較

2.3 Western Blot檢測淋巴液中TLR4水平 3組大鼠淋巴液中TLR4蛋白表達比較差異有統計學意義(厚樸酚治療組 vs SAP組 vs 假手術組：0.405±0.022 vs 0.588±0.037 vs 0.302±0.194,F=170.536,P<0.01),進一步兩兩比較，厚樸酚組及假手術組均低于SAP組(P值均<0.05)(圖6)。

2.4 肺濕/干重比 3組大鼠肺濕/干重比比較差異有統計學意義(厚樸酚組 vs SAP組 vs 假手術組:3.51±0.09 vs 4.64±0.15 vs 2.83±0.20,F=205.930，P<0.001)，進 一步兩兩比較，SAP組高于厚樸酚治療組及假手術組(P值均<0.05)。

3 討論

SAP時由于體液的大量丟失，體內循環血流量明顯減少，交感神經興奮，使腸道血管發生強烈收縮，腸道缺血、缺氧，黏膜屏障功能破壞，細菌、內毒素易位入血，形成腸源性感染，導致中毒性腸麻痹、腸衰竭[7-8]。腸衰竭導致細菌、毒素吸收入血，腸道菌群移位，引發其他臟器的功能障礙。SAP相關性肺損傷是SAP早期最常見、最嚴重的并發癥。

厚樸酚為厚樸提取物重要的單體成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗內毒素、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，臨床上主要用于炎癥、細菌感染等疾病的治療[9-10]。段金旗等[11]發現,厚樸酚能顯著改善膿毒癥大鼠肺組織結構，減少炎癥細胞浸潤，降低TNFα、IL-1β、IL-6，細胞間黏附分子1、巨噬細胞炎癥蛋白2、丙二醛水平以及黃嘌呤氧化酶活性，提高超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性，最終抑制膿毒癥引起的大鼠急性肺損傷，其機制可能與阻斷NF-κB信號通路有關。

Seely等[12]研究顯示，SAP患者IL-1 、IL-8血清水平顯著高于健康組。這些炎癥因子對炎癥反應起正反饋作用, 可加重SAP。IL-8可與中性粒細胞表面的特異性受體結合, 導致白細胞發生變形反應，脫顆粒，釋放蛋白溶解酶和活性氧, 從而引起組織損傷的發生。IL-1β能促進白細胞在炎癥胰腺的聚集并能激活中性粒細胞，在SAP的多臟器功能衰竭的發生發展中起著重要作用。IL-1β可促使骨髓釋放中性粒細胞，并聚集在肺部釋放溶酶體酶2誘導TNFα、IL-6的生成[13]。IL-10是人體中發現的少數抗炎因子之一，主要由輔助性T淋巴細胞(Th)產生，也可由B淋巴細胞、單核細胞和肥大細胞產生，能抑制Th1釋放細胞因子。內源性和外源性的IL-10均能在轉錄水平上強烈抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNFα、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子的合成。IL-10主要是通過NF-κB的DNA結合能力，抑制NF-κB啟動相關前炎癥因子基因的轉錄。劉志勇等[14]發現，AP大鼠造模12 h后，血清中IL-10水平高于假手術組。宋潤波等[15]發現，SAP大鼠造模6 h后血清中IL-10水平與假手術組的差異均無統計學意義，造模12 h后血清中IL-10水平高于假手術組，且差異均具有統計學意義。本實驗中3組IL-10水平差異均無統計學意義，考慮與實驗造模時間短有關。TNFα主要由單核細胞和巨噬細胞產生, 是SAP相關肺損傷重要的炎性細胞因子。30%～40%的AP患者TNFα水平增加[16]。在SAP被誘發1 h后，胰腺組織及血清TNFα即可被檢測到，并在其后的6 h內迅速上升，其升高程度與胰腺損傷及炎癥程度直接相關[17]。陸海華等[18]研究發現, AP相關肺損傷組TNFα表達水平明顯高于AP組, 差異有統計學意義，與本實驗結果一致。HMGB1廣泛分布于哺乳動物細胞內，可在炎癥晚期發揮作用。HMGB1能通過激活機體單核/巨噬細胞、中性粒細胞，增加炎癥因子的釋放，參與全身炎癥反應；它還能損傷內皮功能，促使纖溶水平失衡，增加腸黏膜通透性[19]。SAP胰腺損傷與HMGB1的異常表達相關，SAP時血清及胰腺組織中HMGB1表達均可增強[20]。當HMGB1主動或者被釋放到細胞外時通過TLR4受體通路，刺激免疫細胞產生炎性介質，形成惡性環路，使AP病情不斷加重。TLR4是發現最早的TLR亞型之一，TLR4的表達受IL-4、TLR4增強子、IL-1β等細胞因子的影響。RAGE與HMGB1具有高度親和力，HMGB1和RAGE進行結合以后，使NF-κB因子向核內轉移，引起整條炎性信號通路的激活，并進一步誘導分泌大量炎性因子、趨化因子，參與炎性細胞激活、遷移和趨化作用等[21]。

本研究發現，厚樸酚能夠改善腸屏障功能，降低淋巴液及血清中炎癥因子水平，抑制HMGB1-TLR4/NF-κB信號轉導通路，減輕SAP肺損傷，這為中西醫結合治療SAP提供了的思路。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：王燕負責數據采集及分析，實驗實施，撰寫論文；齊文杰參與實驗實施，修改論文；曾亞薇、谷培云參與實驗實施；苗彬負責課題設計，資料分析，修改論文，指導撰寫文章。