地中海貧血患者血漿環狀RNA的篩查及結果分析

周獻青，張岳，林華，薛雯，陳潔晶，歐明林

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二四醫院檢驗科廣西代謝性疾病研究重點實驗室，廣西 桂林 541002

地中海貧血(thalassmeia，簡稱地貧)是因珠蛋白基因缺陷導致血紅蛋白中相應珠蛋白肽鏈合成缺失或不足，最終引起溶血性貧血等病理狀態[1]。據資料顯示，地貧在廣西人群中有較高發病率[2]，嚴重威脅人類健康。

環狀RNA(circRNA)是近幾年來發現的一種新型的內源性非編碼RNA，由前體mRNA 下游序列(3'端)與其上游的RNA 序列(5'端)反向剪切形成環形結構[3]。circRNA在真核細胞中具有豐富、保守及穩定的特性，在生物體內調控靶基因的表達、基因轉錄和蛋白質生成。越來越多的研究證明，circRNA 可通過發揮其在生物學上的功能來參與疾病的發生發展機制，在腫瘤、神經系統、免疫系統等人類多種疾病中具有重要作用，在成為疾病預防、診斷、治療及預后的新型生物標志物上顯示巨大潛力[4-8]。隨著測序技術的發展與學者們對circRNA 的認識不斷加深，circRNA 與血液疾病的關系也逐漸被發現，影響疾病發生發展，本研究擬通過基因芯片法檢測地貧患者外周血中差異表達的circRNA，期望發現地貧診斷的潛在標志物，為疾病診斷方法的建立提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1～12 月年桂林第924 醫院入院治療的α-地貧東南亞缺失型患者10 例作為實驗組，男性3 例，女性 7 例，年齡(35.5±7)歲，均符合地貧診斷標準。根據配對原則，設置對照組為健康體檢合格人群10例，男性5例，女性5例，年齡(31.1±4.0)歲。兩組受檢者清晨空腹抽取外周血3.5 mL。本研究方案經廣西代謝性疾病研究重點實驗室倫理委員會批準同意。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol (美國Invitrogen公司)，PCR 試劑盒(美國Takara公司)，RNA酶抑制劑試劑盒 (美 國 Epicentre 公 司)，SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase(美國Invitrogen公司)，Primer(中國英駿生物技術有限公司)；熒光定量PCR 儀(美國BIO-Rad公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，DNA 微陣列掃描儀(美國Agilent 公司)，超凈工作臺(上海上凈凈化設備有限公司)；基因芯片AS-S-CR-H-V2.0 (Arraystar公司)。

1.3 方法

1.3.1 血漿提取 將實驗組、對照組血樣置于高速離心機中，3 500 r/min，離心5 min。離心后取出，在超凈工作臺上使用移液槍吸取上層淡黃色血漿500 μL，保存于無菌的EP管中，超低溫冰箱保存待用。提取的血漿分兩份，一份用作基因芯片法初篩與相關的circRNA，另一份用作熒光定量PCR法驗證篩選的circRNA。

1.3.2 基因芯片法篩選差異表達circRNA 通過NanoDrop ND-1000測定樣品總RNA樣品的純度和濃度，RNA質控結果見表1。提取實驗組、對照組血漿總RNA，利用基因芯片AS-S-CR-H-V2.0 進行標記基因序列雜交。首先，用Rnase R (E picentre，Inc.)消化酶解樣品總RNA，去除線性RNA，富集circRNARNA。第二，利用隨機引物法擴增樣品circRNA 轉錄cRNA，并進行熒光標記；RNeasy Mini Kit (Qiagen)對標記的cRNAs進行純化處理；利用NanoDrop ND-1000測量成功標記的cRNA(pmol Cy3/μg cRNA)的濃度比活性。第三，在5 μL 10×阻斷劑和1 μL 25×裂解緩沖液中添加1 μg標記cRNA以進行片段處理，60℃孵育30 min，后加入25 μL 2×雜交緩沖進行稀釋。第四，吸取50 μL雜交溶液滴加在circRNA 基因芯片載玻片，65℃孵育17 h。最后，對circRNA 基因芯片進行清洗、固定、掃描，提取芯片數據，進行數據分析，尋找實驗組與對照組間差異表達的circRNA，通過Fold Change進行篩選circRNA，驗證差異倍數較大circRNA。

表1 總RNA的定量和質控結果

1.3.3 熒光定量PCR 驗證 提取實驗組、對照組血漿總RNA，逆轉錄合成cDNA。根據上一步篩選差異表達的circRNA，使用Primer 5.0，進行引物設計，見表 2。PCR 反應體系：2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L的PCR特異引物F 0.5 μL，10 μmol/L 的PCR特異引物R 0.5 μL，cDNA 2 μL，加水至總體積為 10 μL。按照PCR 操作步驟進行擴增，95℃，10 min；40個PCR循環[95℃，10 s；60℃，60 s(收集熒光)]。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按95℃，10 s-60℃，60 s-95℃，15 s的順序加熱；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進行-Ramp Rate為0.05℃/s)。反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線，將閾值手定設定在0.015。

表2 引物序列表

1.4 數據分析 使用R 軟件limma 軟件包對原始數據進行分位數標準化及數據處理。通過散點圖、聚類熱圖等表現差異表達的circRNA。通過生物信息學Circular RNA Interactome 數據庫(https://circinteractome.nia.nih.gov/)對上、下調 circRNA 進行 miRNA 預測。circRNA 驗證以管家基因β-actin 作為內參基因，取平均 Ct 值作為該樣本最后 Ct 值，計算 2-ΔΔCt值反映驗證circRNA表達水平。以管家基因β-actin(不同circRNA 的表達量基本恒定)作為內參，以地貧組circRNA 待測基因的值除以此樣品內參的值，最終得到的比值該待測基因相對含量，倍數為地貧組的相對表達量除以對照組的相對表達量。對照組設定是1，上調表達閾值大于1，下調表達閾值大于0小于1。

2 結果

2.1 circRNA篩查數據 通過基因芯片法分析地貧實驗組和健康對照組血漿中circRNA的相對表達水平，熒光信號清晰且無邊緣化效應，背景強度低，結果可靠。經芯片掃描后，共檢測到8 312個circRNA，如果以2.0倍為標準閾值，差異表達84個circRNA，47 個上調表達circRNA(＞2.0)，37個下調表達circRNA(＜-2.0)。表3整理了差異表達前10個上調circRNA，有hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_100789等，以及差異表達前10 個下調circRNA，有hsa_circRNA_001496、 hsa_circRNA_402563、hsa_circRNA_405439等。通過Circular RNA Interactome數據庫對差異表達的進行circRNA進行靶miRNA預測。表4整理了部分差異表達的上調和下調circRNA與其靶miRNA。通過圖1散點圖可知，X軸代表健康對照組，Y軸代表地貧實驗組，綠線代表1.5倍變化閾值。在綠線上方說明circRNA上調表達超過1.5倍，在綠線下方說明circRNA下調表達超過1.5倍，存在部分circRNA上調表達超過1.5倍，下調表達超過1.5倍。

表3 地貧患者血漿前10個差異表達的上調和下調的circRNA

表4 部分差異表達的上/下調circRNA 與其靶miRNA

2.2 circRNA 驗證數據 為了進一步研究篩選出來差異表達的circRNA 在地貧患者中的真實表達，隨即通過熒光定量PCR 實驗對篩選出來的circRNA進行驗證。circRNA驗證結果見表5，由相對表達量及表達倍數可知，差異表達的上調circRNA 是hsa_circRNA_100790，差異表達的下調circRNA 是 hsa_circRNA_001496，其表達趨勢與初篩結果一致。hsa_circRNA_100790與hsa_circRNA_001496熔解曲線見圖2，無特異性擴增。

圖1 差異表達的circRNA

表5 驗證circRNA的相對表達量

圖2 hsa_circRNA_100790和hsa_circRNA_001496熔解曲線

3 討論

cirRNA 作為常見的競爭內源性RNA 的一種，調控靶基因轉錄和轉錄后的表達，在哺乳動物體內中廣泛存在，影響發育、器官形成、細胞增殖及凋亡等多項生物進程。近年來，隨著高通量技術和生物信息學的快速發展，特別是RNA-seq 技術誕生后，人們對circRNA的研究越來越深入，circRNA在作為人類疾病診斷與治療的生物標記物上顯示出巨大的潛能。目前地貧患者circRNA研究尚未見報道。

circRNA可與多個miRNA競爭性結合，充當miRNA 的海綿，從而調節miRNA 靶基因的表達，進而影響生物體的細胞、組織正常發育，參與免疫反應，調控地貧的發生發展過程。目前對于地貧患者中circRNA的功能研究還比較少，可以通過預測與circRNA 結合的miRNA，進而間接推測circRNA 的生物學功能。miRNA在地貧(β型)患者紅細胞增生和幼紅細胞比例增高發揮重要作用。miR-144/451在成熟紅細胞存在高表達[9]，過高的表達量常與疾病的發生發展有關。鄧妮[10]在地貧(β型)雜交小鼠體內、在地貧(β型)患者的前體紅細胞中都觀察到了miR-144/451表達量明顯升高，把地貧(β型)雜交小鼠體內的miR-144/451敲除時，小鼠的貧血等癥狀得到明顯改善；隨后檢測了miR-144/451 在小鼠外周血、骨髓以及胚胎肝紅細胞中表達趨勢，進一步驗證了miR-144/451基因表達缺失可以很好改善貧血癥狀，由此說明miR-144/451調控了地貧(β型)患者體內紅細胞的成熟過程，miR-144/451可通過干預紅細胞的生成進而達到疾病的治療及預后目的。SVASTI 等[11]通過熒光定量PCR 也觀察到miR-451在地貧(β型)患者純化紅細胞祖細胞培養中的雙相上調。地貧(β型)患者中觀察到不同胎兒血紅蛋白(HbF)水平可能很大程度上受miR-486-3p 調控[12]。γ-珠蛋白的表達水平跟地貧(β型)發展息息相關，紅血球細胞中miR-486-3p上調表達，導致BCL11A基因表達減少，γ-珠蛋白基因表達增加；重型地貧(β型)患者中γ-珠蛋白基因持續表達，BCL11A基因相對表達量表達下降[13]；在K-562細胞系中，miR-26b調控γ-珠蛋白基因上調表達，基于miR-26b對γ-珠蛋白表達的誘導作用，學者認為miR-26b在未來靶向治療中有可能將其應用于地貧治療[14]。在地貧患者的紅細胞生成過程中，hsa-miR-503下調表達，甚至缺失，出現貧血特征[15]。

circRNA 廣泛存在于的機體各種組織細胞中，具有高度穩定性，對多種疾病調控功能。隨著檢測技術發展，將更有利于尋找更多的circRNA，并且探明其具體的功能。但目前有關地貧的circRNA 的研究仍處于起步階段，如孫士鵬等[16]探討了地貧分子機制及其相關microRNA 表達調控的研究進展等，在疾病發生發展過程中具體的機制仍不是很清楚，因此明確circRNA 的靶基因及其對靶基因的作用對人們深入了解地貧發病機制和預后治療都有著重要的意義。

綜上所述，本研究表明在地貧患者外周血血漿中發現大量差異表達circRNA，circRNA 有可能作為地貧新的生物標志物和精準治療靶點，可能為未來地貧的療效評估、預后判斷帶來新的希望。