循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胃癌臨床分期判斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值

劉霞，董麗娟，張軍鵬，賀繼東，薛海蘭，王順

寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科1、檢驗(yàn)科2，陜西 寶雞 721000

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球胃癌新發(fā)病例約95.1萬(wàn)例，死亡病例約72.3萬(wàn)例，其發(fā)病率和死亡率分別居全球惡性腫瘤的第四位和第三位，多發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1-2]。據(jù)2012年我國(guó)腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示，胃癌新發(fā)病例約42.4 萬(wàn)例，死亡病例約29.8 萬(wàn)例，約占全世界的50%，疾病負(fù)擔(dān)重[3]。大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已處于中晚期，失去最佳治療時(shí)機(jī)及方案，預(yù)后較差[4]。此外，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)亦是影響胃癌預(yù)后的重要原因，血行轉(zhuǎn)移是其主要方式，與循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)相關(guān)，外周血中CTCs數(shù)量稀少，對(duì)檢測(cè)方法有較高的要求，研究受限[5-6]。近年，隨著檢測(cè)技術(shù)不斷完善，CTCs檢出率明顯升高，其作為一種新型非侵入性診斷工具，在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤早期診斷、療效評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)中展現(xiàn)出巨大的價(jià)值[7-8]。本研究旨在探討外周血CTCs在胃癌臨床分期判斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2015 年 6 月至 2017 年 6 月于寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科診治的130 例胃癌患者(胃癌組)納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前胃鏡取活檢病理確診為胃癌者；②入組前未給予任何抗腫瘤治療者；③均行胃癌根治性手術(shù)者；④治療依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕期或哺乳期患者；②存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；③合并其他任何惡性腫瘤者；④合并肝腎功能及凝血功能障礙者。胃癌組患者中男性90 例，女性40例；年齡22～80 歲，平均(49.24±10.46)歲；按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第 7 版 TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中Ⅰ期 23 例，Ⅱ期39 例，Ⅲ期 68 例；T1～2期 51 例，T3～4期 51 例 79 例；N0期40 例，N1～3期 90 例。選取同期 40 例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性 27 例，女性 13 例；年齡25～78 歲，平均(50.11±10.92)歲。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批件號(hào)：2020 倫委會(huì)字第(001)號(hào)]，所有受檢者自愿參加本研究，且簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采用EDTA抗凝采血管收集健康對(duì)照組和胃癌組(入組后第1 天和術(shù)后第3 天)外周血5 mL，顛倒混勻10 次(抗凝血)，若不能及時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，須在2℃～8℃保存。

1.2.2 外周血CTCs 富集[8]采用CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)完成外周血CTCs富集，具體操作如下：第一，加紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫靜置30 min，1 850 r/min 離心10 min，去上清；第二，加固定劑混勻靜止8 min，后將其與納米濾膜過(guò)濾器和真空泵連接，制備得到細(xì)胞濾膜，實(shí)現(xiàn)CTCs納米技術(shù)截留及富集，最后用甲醛固定60 min。

1.2.3 RNA 多重原位雜交分析(RNA in situ hybridisation，RNA-ISH)[10]固定后，將細(xì)胞濾膜依次進(jìn)行親水-透化-消化-探針雜交-預(yù)擴(kuò)增-擴(kuò)增-顯色7個(gè)步驟，后在樣本上加抗淬滅劑(含DAPI)，放置5 min后在自動(dòng)識(shí)別系統(tǒng)上完成熒光信號(hào)識(shí)別(CTCs 類型不同，熒光信號(hào)不同)，其儀器為FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)BD 公司)。其中上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)基因探針包括EpCAM、CK8、CK18、CK19、Vimentin、Twist 和 CD45。參考RNAscope Multiplex Assay Kit 試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行判斷，CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn)：CTCs 陽(yáng)性-CTCs 數(shù)量≥2 個(gè)/5 mL，CTCs 陰性-CTCs數(shù)量＜2個(gè)/5 mL；CTCs分型判斷標(biāo)準(zhǔn)：上皮型CTCs顯示為紅色熒光信號(hào)點(diǎn)(CD45 表達(dá)陰性；EpCAM/CK8/CK18/CK19表達(dá)陽(yáng)性)，間質(zhì)型CTCs顯示為綠色熒光信號(hào)點(diǎn)(CD45表達(dá)陰性；Vimentin/Twist表達(dá)陽(yáng)性)，混合型CTCs同時(shí)顯示紅色和綠色熒光信號(hào)點(diǎn)。

1.3 隨訪 出院后對(duì)130 例胃癌患者進(jìn)行隨訪，包括電話和門(mén)診復(fù)診，共隨訪3 年，截止日期為2020年7月，終點(diǎn)事件為復(fù)發(fā)和死亡，記錄其無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free-survival，PFS)和 總 生 存 期 (overall survival，OS)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)分析CTCs 與胃癌臨床分期的關(guān)系，采用Wilcoxon (W)檢驗(yàn)分析CTCs 與胃癌療效的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法和Log-rank法分析CTCs與胃癌預(yù)后的關(guān)系，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的CTCs檢測(cè)結(jié)果比較 對(duì)照組受檢者CTCs 檢測(cè)均為陰性；胃癌組患者中，CTCs 陽(yáng)性者117例(90.00%)，其中CTCs均數(shù)為5(0～42)：上皮型均數(shù)為1.8(0～20)、混合型均數(shù)為3.5(0～42)和間質(zhì)型均數(shù)為1.5(0～8)，見(jiàn)圖1。

圖1 CTCs分型(×400)

2.2 CTCs 與胃癌臨床分期的關(guān)系 CTCs 檢出率在不同T 分期、N 分期和AJCC 分期上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；CTCs 分型在不同 N 分期和AJCC分期上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但在不同T分期上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 胃癌患者手術(shù)治療前后CTCs 檢出率和CTCs分型比較 術(shù)前、術(shù)后胃癌患者CTCs檢出率和CTCs分型比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 CTCs與胃癌臨床分期的關(guān)系[例(%)]

表2 胃癌患者手術(shù)治療前后CTCs檢出率和CTCs分型比較[例(%)]

2.4 CTCs與胃癌預(yù)后的關(guān)系 截至隨訪終止日期，所有胃癌患者均未失訪。117例CTCs陽(yáng)性胃癌患者中，45 例進(jìn)展，72 例未進(jìn)展；40 例死亡，77 例生存；13例CTCs陰性胃癌患者中，2例進(jìn)展，11例未進(jìn)展；1例死亡，12例生存。CTCs陰性胃癌患者和CTCs陽(yáng)性胃癌患者無(wú)進(jìn)展生存率[85%(11/13)vs 62%(72/117)]和總生存率[92(12/13) vs 66%(77/117)]比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。CTCs陽(yáng)性胃癌患者中，CTCs 上皮型、混合型和間質(zhì)型的患者無(wú)進(jìn)展生存率[(84%(26/31)vs 69%(34/49)vs 32%(12/37)]和總生存率[94%(29/31)vs 73%(36/49)vs 32%(12/37)]比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 CTCs檢測(cè)與胃癌預(yù)后的生存曲線圖

圖3 CTCs分型與胃癌預(yù)后的生存曲線圖

3 討論

近年，我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速，生活環(huán)境和國(guó)民生活方式均改變明顯，胃癌發(fā)生率明顯升高，但預(yù)后無(wú)明顯改善，與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。1896年，ASHWORTH[12]從在研究轉(zhuǎn)移性腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，患者血液中存在一種與腫瘤細(xì)胞極為相似的血細(xì)胞，并提出了CTCs的概念，表明外周血中檢測(cè)到的CTCs 主要來(lái)源于原腫瘤灶，通過(guò)相關(guān)通路到達(dá)相應(yīng)器官并形成轉(zhuǎn)移灶。有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤患者在某些尚未形成能夠被影像學(xué)所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶之前，外周血中CTCs檢測(cè)已存在陽(yáng)性，提示CTCs檢測(cè)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)意義重大[13-14]。

隨后，越來(lái)越多研究提示，外周血CTCs在腫瘤診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值[15]。但由于技術(shù)限制，CTCs在臨床應(yīng)用較少。目前，CTCs檢測(cè)方法包括光導(dǎo)纖維陣列掃描(fiber-opticarray scanning technology，F(xiàn)AST)、激光掃描細(xì)胞計(jì)量技術(shù)(laser scanning cytometry，LSC)、CTC 芯片技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT) 及 Cell-Search System等，其中最具代表的是經(jīng)美國(guó)食品和藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)并用于臨床的 CellSearch 系統(tǒng)[16-17]。與 CellSearch 一代不同，CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)不僅利用納米濾膜快速富集CTCs，還以 EpCAM、CK、Vimentin、Twist、AKT 及Snail 等多種標(biāo)志物mRNA 為靶標(biāo)進(jìn)行RNA原位雜交以進(jìn)行CTCs分型，具有高靈敏性、高特異性及可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)[18]。

在本研究中，40 例健康體檢者CTCs 檢測(cè)均為陰性，130例胃癌患者中CTCs陽(yáng)性者117例，檢出率高達(dá)90.00%，與T 分期、N 分期和AJCC 分期相關(guān)，分期越晚，CTCs 檢出率越高，提示CTCs 可能通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，與楊艷麗等[19]研究結(jié)果基本一致，再次強(qiáng)調(diào)了CTCs在胃癌中的價(jià)值。隨后，本研究還探討了CTCs檢出與胃癌手術(shù)治療前后和預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，術(shù)后CTCs 檢出率明顯低于術(shù)前，CTCs陽(yáng)性者 PFS 和 OS 均低于 CTCs 陰性者，提示 CTCs 檢測(cè)對(duì)胃癌療效評(píng)估和預(yù)后監(jiān)測(cè)有一定價(jià)值，為本文重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)之一，為胃癌患者診療提供了新的方向。

研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)腫瘤細(xì)胞在從原發(fā)灶脫離進(jìn)入血液循環(huán)后會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變，根據(jù)此特征可將CTCs可分為上皮型、間質(zhì)型和混合型(上皮-間質(zhì))，以間質(zhì)型惡性程度最高[20]。在本研究117 例CTCs 陽(yáng)性患者中，上皮型、混合型和間質(zhì)型CTCs 分別為30 例、50 例和 37 例，T 分期、N 分期和 AJCC 分期越晚，間質(zhì)型CTCs占比越大，與前述結(jié)論基本一致。此外，本研究還探討了CTCs分型與胃癌手術(shù)治療前后和預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，術(shù)前術(shù)后CTCs 分型差異明顯，以間質(zhì)型CTCs 減少為主；CTCs 分型不同，其 PFS 和 OS 比較差異明顯，以間質(zhì)型CTCs 患者PFS 和OS 生存率最低，生存時(shí)間最短，提示CTCs 分型在一定程度上可代表胃癌惡性程度，評(píng)估其療效，預(yù)測(cè)其預(yù)后，在一定程度上可完善胃癌診療系統(tǒng)。

綜上所述，CTCs 在胃癌中檢出率高，且具有不同分型，與臨床分期、療效及預(yù)后密切相關(guān)，綜合CTCs總數(shù)和分型檢測(cè)，為胃癌患者診療及預(yù)后提供新的方向。但本研究樣本量和觀察時(shí)間均相對(duì)有限，今后將通過(guò)擴(kuò)大樣本量和延長(zhǎng)觀察時(shí)間驗(yàn)證本研究結(jié)論，以便推廣。