長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01296對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

釗雯婧，楊芬，夏睿，吳鵬，陳錦飛

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院，南京210006；2南京醫(yī)科大學(xué)；3南京市胸科醫(yī)院

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均較高，但發(fā)生機(jī)制仍不明確[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt，缺少完整開(kāi)放閱讀框，沒(méi)有蛋白編碼功能的RNA分子，在非編碼RNA中占有相當(dāng)大的比例，參與多種表觀調(diào)控及腫瘤發(fā)生過(guò)程[2]。lncRNA最初被認(rèn)為是基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的“暗物質(zhì)”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不執(zhí)行生物學(xué)功能；但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，影響基因的生物學(xué)功能，從而參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[3,4]。研究表明，lncRNA異常表達(dá)可以影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)功能，在腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮促癌基因或者抑癌基因的作用[5]。2017年10月～2019年10月，本研究觀察了LINC01296在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。主要試劑：FBS購(gòu)自美國(guó)Scien Cell公司，DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、Opti-MEM分別購(gòu)自美國(guó)Invitrogen、Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；小干擾RNA(siRNA)以及陰性對(duì)照RNA(siNC)均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 細(xì)胞LINC01296表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將SGC-7901、BGC-823及GES1細(xì)胞接種于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，光密度(OD)260/2801.9～2.1為合格的RNA樣本。取總RNA 1 μg，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。LINC0296上游引物5′-AGGCTGACTCAGGAAATGCTT-3′，下游引物5′-TGCTTTATTGTGGTGGTCTCG-3′，引物長(zhǎng)度21 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3′，下游引物5′-AGGAATCCTTCTGACCCATGC-3′，引物長(zhǎng)度23 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC01296相對(duì)表達(dá)量。

1.3 LINC01296對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天將SGC-7901、BGC-823細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)，待第2天細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Opti-MEM分別孵育siRNA、siNC及Lipofectamine2000，靜置5 min。將Opti-MEM與Lipofectamine2000混合液體分別加入siRNA與siNC中，混勻后靜置20 min。將SGC-7901、BGC-823細(xì)胞各分為兩部分，分別加入上述siRNA與siNC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h收集細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) ①CCK-8法：收集分別轉(zhuǎn)染siRNA、siNC 24 h后的SGC-7901、BGC-823細(xì)胞，以3×103/孔接種于96孔板，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。加入完全培養(yǎng)基，使每孔終體積為200 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。每孔加入CCK-8試劑20 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②克隆形成實(shí)驗(yàn)：收集分別轉(zhuǎn)染siRNA、siNC 24 h后的SGC-7901、BGC-823細(xì)胞，以1×103/孔接種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。10～14 d后細(xì)胞形成肉眼可觀察到的克隆集落，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗2次。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，清洗后干燥，肉眼觀察計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 LINC01296在胃癌細(xì)胞中的分布觀察 采用胞質(zhì)胞核分離實(shí)驗(yàn)。將SGC-7901、BGC-823細(xì)胞接種于10 cm×10 cm培養(yǎng)皿中，至細(xì)胞融合度為90%時(shí)收集細(xì)胞。使用PARIS試劑盒進(jìn)行細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分的分離，PBS沖洗后胰酶消化細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中，4 ℃條件下500 r/min離心5 min，棄去上清。加入fractination Buffer 500 μL，輕輕吹打后冰上靜置5 min。再次在相同條件下離心，上清即為細(xì)胞質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移至新的2 mL EP管中，沉淀即為細(xì)胞核。分別對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄，參照1.2采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)LINC01296在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的CT值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)比例。細(xì)胞核相對(duì)表達(dá)比例=2細(xì)胞核CT-細(xì)胞質(zhì)CT/(1+2細(xì)胞核CT-細(xì)胞質(zhì)CT)×100%，細(xì)胞質(zhì)相對(duì)表達(dá)比例=1-細(xì)胞核相對(duì)表達(dá)比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 LINC01296與EZH2、SUZ12的相互作用觀察 采用RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。將SGC-7901、BGC-823細(xì)胞分別溶解于完整的RIP裂解緩沖液中，RIP裂解緩沖液含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。4 ℃條件下，將細(xì)胞提取物與特定抗體偶聯(lián)的磁珠或?qū)φ誌gG進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間6 h；將磁珠洗凈并與蛋白酶K孵育以去除蛋白質(zhì)，冰上孵育5 min，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min。室溫條件下，將磁珠與IP級(jí)抗EZH2抗體或抗SUZ12抗體5 mg混合，旋轉(zhuǎn)孵育30 min。取上清液，加入RNA免疫沉淀緩沖液中，4 ℃過(guò)夜。同時(shí)對(duì)正常對(duì)照IgG進(jìn)行檢測(cè)，以確保檢測(cè)到的信號(hào)來(lái)自與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的RNA。將產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以IgG作為陰性對(duì)照，其與LINC01296的結(jié)合設(shè)為1，分析LINC01296相對(duì)于IgG結(jié)合EZH2和SUZ12情況。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823及GES1細(xì)胞LINC01296表達(dá)比較 SGC-7901、BGC-823及GES1細(xì)胞LINC01296相對(duì)表達(dá)量分別為4.04±1.64、5.33±1.32、1.41±0.01，SGC-7901、BGC-823細(xì)胞LINC01296相對(duì)表達(dá)量均高于GES1細(xì)胞(P均<0.05)。

2.2 SGC-7901、BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后OD值和克隆形成個(gè)數(shù)比較 轉(zhuǎn)染siRNA、siNC的SGC-7901細(xì)胞OD值分別為1.20±0.03、1.38±0.02，克隆形成數(shù)分別為(112.56±5.22)、(256.14±6.42)個(gè)，二者比較P均<0.05；轉(zhuǎn)染siRNA、siNC的BGC-823細(xì)胞OD值分別為1.50±0.04、1.73±0.22，克隆形成個(gè)數(shù)分別為(98.21±5.56)、(203.76±5.31)個(gè)，二者比較P均<0.05。

2.3 LINC01296在SGC-7901、BGC-823細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)比例比較 LINC01296在SGC-7901細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)比例分別為82.13%±1.97%、17.87%±1.97%，在BGC-823細(xì)胞中分別為94.22%±0.90%、5.81%±0.89%；LINC01296在SGC-7901、BGC-823細(xì)胞核中的相對(duì)表達(dá)比例均高于細(xì)胞質(zhì)(P均<0.05)。

2.4 LINC01296與EZH2、SUZ12的相互作用結(jié)果 SGC-7901細(xì)胞中LINC01296相對(duì)于IgG與EZH2、SUZ12結(jié)合的相對(duì)表達(dá)量分別為7.83±0.68、4.52±0.87，BGC-823細(xì)胞分別為9.15±0.56、5.01±0.27。

3 討論

目前我國(guó)胃癌的診斷主要依賴于胃鏡下取活組織檢查，該檢查為有創(chuàng)檢查，不易為患者接受[6,7]。雖然一些腫瘤標(biāo)志物(CA125、CEA)與可用于胃癌篩查，但是其特異度和敏感度較低，大部分患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為進(jìn)展期胃癌，5年生存率較低，預(yù)后較差[8]。因此，臨床上亟需找到特異度和敏感度均較高的腫瘤標(biāo)志物，以提高胃癌早期診斷率，從而改善患者預(yù)后。在人類基因組中，大約有23 000個(gè)lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)取ncRNA可作為促癌基因或者抑癌基因，通過(guò)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移、凋亡、血管形成等過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用[9,10]。研究表明，lncRNA異常表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究結(jié)果顯示，LINC01296在胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823中的表達(dá)均高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1，而沉默胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823的LINC01296表達(dá)后，其增殖能力下降；這表明LIN01296在胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，LINC01296具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用，其可能作為促癌因子參與了胃癌的發(fā)生。

為了研究LINC01296促進(jìn)胃癌發(fā)生的作用機(jī)制，我們通過(guò)胞質(zhì)胞核分離實(shí)驗(yàn)確定其在細(xì)胞中的定位；結(jié)果顯示LINC01296主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞核，表明其可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控特定靶基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。表觀抑制因子PcGs是表觀遺傳變化的重要調(diào)控因子，在物種間具有較好的保守性。PcGs主要包括PRC1和PRC2兩種復(fù)合體，兩種復(fù)合體由于結(jié)構(gòu)不同而發(fā)揮不同作用。PRC1主要發(fā)揮泛素連接酶的作用，而PRC2發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，可以催化組蛋白H3K27的甲基化修飾[12,13]。PRC2復(fù)合體尤其是其主要組成部分EZH2、SUZ12在多種腫瘤中表達(dá)異常。EZH2是PRC2復(fù)合體的核心組成部分，通過(guò)EZH2和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)之間的相互作用，可將H3K27和CpG甲基化聯(lián)系起來(lái)，導(dǎo)致DNA高甲基化，從而引起H3K27me3基因沉默[6,14,15]。EZH2不僅可以通過(guò)抑制基因轉(zhuǎn)錄而沉默基因表達(dá)，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過(guò)程。EZH2和SUZ12在卵巢癌、前列腺癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，其在胃癌組織中的表達(dá)也高于癌旁正常胃上皮組織[16～18]。研究表明，lncRNA可通過(guò)參與調(diào)控EZH2通路而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本研究RNA免疫共沉淀結(jié)果顯示，LINC01296可以與EZH2和SUZ12結(jié)合；因此，LINC01296可能通過(guò)與EZH2和SUZ12的結(jié)合，調(diào)控下游特定靶基因表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，LINC01296可能通過(guò)與EZH2、SUZ12結(jié)合而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，從而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。但LINC01296與EZH2和SUZ12結(jié)合后可以調(diào)控下游的哪些靶基因以及其調(diào)控的機(jī)制并不明確，未來(lái)需進(jìn)一步探索和深入研究。