結核病自然史的階段劃分及其診斷的現狀與展望

李蒙 高謙

為了實現終止結核病的目標，世界衛生組織提出了一系列側重于對有癥狀的患者進行早期診斷和治療，并對高危人群進行篩查和預防性干預的措施[1]。就目前情況來看，這些措施可能并不足以實現終止結核病的目標。新型冠狀病毒肺炎已經讓我們認識到無癥狀和輕微癥狀感染者在傳播過程中的重要作用[2-3]。然而，在目前的結核病防治策略中，關注最多的是活動性結核病患者。結核病自然史(natural history of tuberculosis)是一種約定俗成的提法，準確地說是人體從感染結核分枝桿菌到發病的過程，這是一個復雜的連續的過程。一般人們將人體從感染結核分枝桿菌到發病作為線性的單一方向的連續過程，但實際上并不是所有人感染后都呈線性發展[4-5]，而且每個階段的持續時間也因人而異[5]。隨著對結核病的認識不斷加深，同時為了不同的目的，人們將這個自然史劃分為不同階段。區分不同階段的目的，是為了更好地研發新的診斷技術、制定精準的防治措施，以更好地控制和消滅結核病。本文中，筆者將就結核病自然史的劃分、各個階段的特征，以及各階段診斷技術的現狀和發展方向進行綜述。

一、 結核病自然史及分期

過去，由于對人體從感染結核分枝桿菌到發病整個過程的認識不足，結核病的自然史被簡單二分為潛伏感染(無癥狀，無傳染性)和活動性結核病(有癥狀，有傳染性)[4]。然而，隨著對結核病自然史認識的深入，大量無癥狀、細菌學陽性患者的發現讓人們意識到，在潛伏感染和活動性結核病外，還應該定義額外的階段[6]。

依據結核分枝桿菌感染到發病過程中人體免疫反應、病理生理變化和臨床診斷意義，不同學者將結核病自然史劃分成不同的更細致的階段，Young等[7]在2009年根據細菌與宿主免疫反應的關系將結核病自然史劃分成固有免疫(固有免疫直接清除感染)、獲得性免疫(固有和獲得性免疫共同清除感染)、靜止期感染(免疫系統控制感染，細菌處于休眠狀態)、活動期感染(免疫系統控制感染，細菌處于復制狀態)和疾病(免疫反應失控，出現結核病癥狀和體征)5個階段，但由于臨床上很難界定這些階段，這一定義并未被廣泛使用。目前，世界衛生組織在2017年定義了潛伏感染[結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)或γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assays，IGRA)陽性，沒有微生物學、影像學等活動性結核病的證據]、臨床前期(疾病開始進展，但無癥狀，沒有微生物學、影像學等活動性結核病的證據)和活動性結核病3個階段[8]。最近，Drain等[5]又在世界衛生組織定義的基礎上，在臨床前期和活動性結核病中間新增加了亞臨床期。但是不管是潛伏感染還是臨床前期，由于目前沒有方法準確區分，實際意義不大。因此，筆者建議合并潛伏感染和臨床前期，將結核病自然史劃分成四個階段：感染清除、潛伏感染、亞臨床結核病和活動性結核病，各階段關系見圖1。

二、 結核病自然史不同階段的定義與特征

結核病自然史的第一階段是感染清除，它是指宿主通過自身能力將結核分枝桿菌清除，或者結核病患者通過抗結核治療完全治愈。此處針對前者進行討論。理論上，感染清除應包括兩部分人群。一類是細菌感染后沒有引起免疫反應就被直接清除，即TST或IGRA持續陰性。過去，人們認為結核分枝桿菌在這類人群體內可能沒有引起免疫反應。但是，近期Li等[9]通過對結核病醫院IGRA持續陰性的醫務人員的血液進行分析發現，部分研究對象對結核分枝桿菌產生了保護性抗體，對這一現象的具體機制還有待進一步研究。另一類人群在感染后激活了宿主的免疫細胞而導致細菌被清除，這類人群激活了特異性的效應T細胞而表現出TST/IGRA陽性。但是，這類人群與潛伏感染者難以鑒別。正因如此，到目前為止關于感染清除的研究寥寥無幾。

第二階段為潛伏感染，指有結核分枝桿菌接觸史，理論上其體內存在活菌，對結核分枝桿菌抗原刺激有持續性免疫應答，但被機體免疫系統控制，沒有活動性結核病的證據[10-11]。過去普遍認為潛伏感染者體內的結核分枝桿菌處于代謝不活躍的休眠狀態，但最近在食蟹獼猴體內進行的研究及肺結核患者體內細菌的單克隆研究結果均表明，潛伏期結核分枝桿菌保持不斷增殖的代謝活躍狀態，宿主的免疫清除與細菌增殖處于動態平衡狀態，導致細菌數量保持恒定[12-13]。關于潛伏感染狀態下結核分枝桿菌在人體內的真實狀態還需進一步研究。潛伏感染者進展為活動性疾病的風險為5%～10%[14-15]，其中，大部分在感染后6～24個月內發病[16]。雖然潛伏感染者的結核病發病風險相對較低，但這仍然構成了終止結核病的一大挑戰。目前，世界衛生組織提出對潛伏感染者進行預防性治療[10]，預防性治療可以明顯降低疾病進展的風險[17]。

第三個階段是亞臨床結核病或稱無癥狀結核病，指有細菌學證據，即用現有檢測方法可以發現體內存在結核分枝桿菌，但缺乏咳嗽、咳痰、發熱、盜汗、體質量減輕等典型的結核病臨床癥狀。早在20世紀40年代，Stiehm[18]就提出了亞臨床結核病的概念；最近，Xu等[19]證明亞臨床結核病患者具有傳播性的研究再次引起大家的關注。Kendall等[4]和Drain等[5]將亞臨床結核病定義為有結核分枝桿菌感染的影像學或細菌學證據，但無結核病臨床癥狀。筆者認為，僅影像學異常的人劃分為亞臨床結核病是不恰當的。因為，結核分枝桿菌是診斷結核病的金標準，既然稱為亞臨床結核病，應該以檢測到結核分枝桿菌為標準。目前，亞臨床患者主要是在進行患者主動篩查(如社區全人群篩查和高危人群篩查)時發現的，而在主動就診患者中的比例較少。如近期在烏干達利用GeneXpert MTB/RIF Ultra于社區進行全民篩查時發現，30%的患者為亞臨床患者[20]；我國2010年結核病流行病學抽樣調查發現，43.1%的患者為亞臨床患者[21]。由于亞臨床患者無癥狀，很少主動就診，同時細菌學證據受到多種因素的影響，如檢測方法、痰液質量等，因此，這一比例很可能會被低估。結核病的傳播依賴于患者將結核分枝桿菌從肺部排出到環境中，一般認為實現排菌的條件為痰涂片陽性和有咳嗽癥狀[22]，大規模的人群調查和隊列研究發現，亞臨床患者更可能涂片陰性[23-24]，因此，其是否具有傳染性存在爭議。但涂片陰性培養陽性患者無疑是傳染源，分子流行學研究提供了確鑿的證據，不同地區其傳播能力不同。在發達國家進行的研究發現，涂陰培陽患者相對于涂陽培陽患者的相對傳播率為0.22～0.24[25-28]，我國研究的結果為0.89[29]。同時，根據基因組和臨床數據重建的系統發育進化樹表明，傳播事件有可能發生在患者臨床癥狀出現之前[19]。傳播并不依賴于典型的臨床癥狀[30]，這是因為一方面癥狀的報告具有主觀性，無癥狀也許并非真的無癥狀，而是癥狀輕微未引起注意；另一方面，無癥狀患者在日常的談話[22]、唱歌[31]等活動中也可能會產生含有結核分枝桿菌的飛沫。因此，雖然傳播能力較低，但亞臨床結核病患者也是結核病傳播不可忽略的重要原因[32-33]。當然，隨著診斷技術的進步，使用更加靈敏的方法將診斷出更多的亞臨床患者。比如，目前的GeneXpert MTB/RIF Ultra就發現很多弱陽性患者[20]，但這些弱陽性患者對結核病防控的意義還不明確。這些是正在自愈的患者，檢測到的是體內死菌的DNA？還是體內僅有少量細菌，機體免疫系統可以控制而不需要治療？這樣的患者是否具有傳播性？這些問題都還需要進一步研究，以明確這部分患者對于結核病防控的重要性。

結核病自然史的第四個階段是活動性結核病，指不僅有細菌學和影像學證據，而且存在典型的結核病臨床癥狀[8]。關于活動性結核病的研究很多，對其認識也比較全面，不再贅述。

需要注意的是，自愈在結核病自然史中是很常見的現象。一項對抗結核藥物使用前的研究報告進行的薈萃分析發現，在抗結核藥物出現之前，大約30%的涂片陽性和80%涂片陰性的肺結核患者能夠長期存活[34]。這提示結核病自愈現象不是僅發生在潛伏感染階段，也可以發生在結核病自然史的任一階段。但由于對結核病患者進行觀察而不予以治療存在嚴重倫理問題，所以開展自愈現象的研究有很大困難。

三、 結核病自然史各階段診斷技術的現狀與展望

筆者將結核病自然史分為4個階段，這樣有利于深入了解各個階段的細菌學和免疫學特征，明確不同階段的診斷目的和需求，更好地為精準防控服務。

(一)潛伏感染與感染清除的鑒別

目前仍沒有特異性診斷感染清除的方法，也沒有直接診斷潛伏感染的方法。目前臨床上常用的間接診斷潛伏感染的方法是TST和IGRA檢測，以及新的EC檢測[結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)重組融合蛋白][35]，這三種方法都是通過檢測宿主的記憶性T細胞間接反映結核分枝桿菌感染情況[36]，其檢測陽性只能提示人體曾經感染過結核分枝桿菌，但不能鑒別體內的細菌是否被清除，無法區別潛伏感染和感染清除。因此，目前將上述檢測結果陽性判定為潛伏感染者，顯然是不合理的。這些人群里包括一部分體內已經沒有結核分枝桿菌，即感染清除的，這樣將過高估計潛伏感染的數量。同時，由于人體抗結核免疫的復雜性，即使是活動性結核病患者，也有近10%～15%的患者其檢測結果呈陰性[37]；另外，本身這種檢測方法的可重復性也存在一定的問題，IGRA重復檢測存在近10%的前后結果不一致的現象[38]。因此，研發能夠鑒別感染清除和潛伏感染的新方法，并進一步提高檢測方法的敏感性和重復性是亟待解決的問題。

(二)預測潛伏感染者的發病風險

診斷潛伏感染者的目的是更精準地進行預防性干預。由于潛伏感染者的發病風險并不相同，因此，怎樣從潛伏感染者中鑒別即將發病的高危人群是目前研究的重點。目前大量的研究結果證明TST和IGRA都不能預測潛伏感染者的發病風險。最近的一項薈萃分析發現，IGRA陽性預測值僅為4.5%(95%CI：3.3%～5.8%)，TST為2.3%(95%CI：1.5%～3.1%)[39]；在南非HIV感染者中進行的長達15個月的隨訪研究發現，IGRA陽性和陰性的參與者發病風險沒有差異[40]；用IGRA對美國移民進行篩查，也未發現檢測陽性和陰性參與者的發病風險存在明顯差異[41]。目前，研發新的潛伏感染者發病風險的分子標志物是研究熱點，其中，以人體血液中特定基因的表達水平作為分子標記表現出良好的預測能力。在南非的青少年中進行的隊列研究發現，檢測血液中16個基因的表達譜，可以預測感染者12個月內結核病的發病風險，敏感度和特異度分別為53.7%和82.8%[42-43]；利用這16個基因中的11個(RISK11)基因的表達水平，也可以較好地預測15個月內結核病的發病風險，其敏感度達到88.6%，特異度為68.9%[40]。對于以血液中的17個 mRNA作為預測標志物的薈萃分析發現，其中8個可以較好地預測未來3個月內的發病風險，敏感度為47.1%～81.0%，特異度均超過90%[44]。在撒哈拉以南非洲地區進行的多中心研究發現，在結核病患者確診前12個月可觀察到血液中皮質醇、谷氨酰胺、犬尿氨酸等代謝變化，用這些標志物預測5個月內發病風險的敏感度和特異度分別為69%和75%[45]。這些分子標志物的發現和進一步驗證，將對精準干預高危人群，阻止其發展成為活動性結核病具有重大意義。另外，目前的研究表明，大多數潛伏感染者是在感染后的6～24個月內發病，而潛伏感染時間越長其發病風險越低[16,46]。因此，研發可以鑒別新近感染和遠期感染的診斷方法對于預防潛伏感染也有很重要的意義。最新的一項研究用QuantiFERON-TB Gold定義新近和遠期感染(6個月內轉陽定義為新近感染，持續陽性1.5年以上定義為遠期感染)，研究者利用流式細胞儀對結核分枝桿菌特異性CD4+T細胞進行分型，發現激活型CFP-10/ESAT-6特異性CD4+T細胞可以較好區分新近感染和遠期感染[47]。

(三)亞臨床結核病的診斷

目前還沒有特異針對亞臨床結核病的診斷技術。過去由于結核病診斷技術相對落后，主要采取對有癥狀或者胸部X線攝片異常的人進行細菌學檢測，使得人們對于亞臨床患者的嚴重性認識不足。隨著技術的發展，利用更靈敏的技術可以發現更多的亞臨床患者。比如，利用GeneXpert MTB/RIF Ultra對社區人群進行全民篩查，發現了一些過去無法發現的亞臨床患者[20]。因此，研發簡單的、快速的、適用于大規模人群篩查的、高敏感度的結核分枝桿菌檢測方法對于診斷亞臨床結核病患者具有重要意義。同時，研發基于宿主免疫反應或不基于痰液樣本的分子標志物也將是亞臨床結核病診斷技術的努力方向。

(四)不依賴于痰液的結核病診斷技術

目前結核病的診斷還主要基于痰樣本的多種細菌學檢測方法，其中，痰液質量對檢測結果的影響很大[48]，而且兒童患者很難得到痰樣本[49]。因此，目前結核病診斷技術的重點是研發不依賴于痰樣本的診斷技術，如血液、尿液、呼吸氣體等標本。目前，比較成熟并被世界衛生組織認可的方法是檢測尿液中的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)。LAM是結核分枝桿菌細胞壁的組成成分，能夠被腎小球濾過存在于尿液中并被其特異抗體檢測。薈萃分析結果表明，在免疫功能嚴重缺陷患者(CD4+T細胞≤100個/μl)中的診斷效果較好，敏感度和特異度分別為56%和90%[50-51]，而在CD4+T細胞≥100個/μl人群中，其敏感度較低，為26%[51]。新的Fuji LAM的最低檢測濃度比之前的Alere LAM低30倍，在兒童結核病患者中兩者診斷特異度相當，但敏感度從30.7%提高到64.9%[52]。賽沛公司的基于檢測血液中3個基因表達水平的Xpert-MTB-HR-Prototype試劑盒，其診斷敏感度為90%，特異度為70%[53]；利用白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-18和血管內皮生長因子診斷結核病的敏感度和特異度分別為85%和65%[54]。目前以游離DNA作為分子標志物的研究仍處于起步階段，通過檢測血液、胸腔積液等體液中游離的結核分枝桿菌DNA診斷結核病的敏感度可以達到63.1%～79.7%[55-57]；最近Oreskovic 等[58]開發了一種高度敏感的序列特異性純化方法，高效提取尿液中結核特異性游離DNA，以GeneXpert MTB/RIF檢測結果為金標準，其敏感度為83.7%，特異度為100%。此外，利用二維氣相色譜法檢測患者呼出氣體中特征性揮發性代謝產物也是一種新的診斷方法。研究發現，結核病患者和健康人呼出氣體中2-丁基-1-辛醇、酒精等碳氫化合物含量存在明顯差異，可以作為新的診斷分子標志物[59]。該方法可以與機器學習相結合，識別最具鑒別力的揮發性代謝物，與GeneXpert MTB/RIF相比，其診斷準確率可達到80%～90%[60]。另外，目前已經研發出更方便快捷的微型傳感器電子鼻(eNose-TB)，可以對呼出氣體進行實時的檢測分析，但其作為篩查工具的效果有待觀察[61]。

研發診斷分子標志物，特別是預測疾病進展風險的分子標志物，難度很大。如對研究對象觀察隨訪時間長，投入大，在發病率低的地區難以開展，而且即使研發出了新產品，也需要在不同的人群中花費長時間和巨大投入進行驗證。因此，目前新的診斷和預測產品的研發進展并不理想。最近的一項大規模臨床隊列研究對血液轉錄標志物進行了驗證[62]，發現所有發病風險預測標志物均未達到世界衛生組織制定的敏感度和特異度要求[8]。新的診斷技術還需要進一步優化。

四、 總結

結核病從感染到發病的自然史是一個連續的動態變化過程，并不能簡單地分為潛伏感染和活動性結核病兩個階段。人為地將這一過程進行細致的劃分，是希望能夠明確結核病各階段的特征，為早期診斷和制定防控措施服務，實現終止結核病的目標。但是，關于結核病自然史還存在很多需要探索的問題，如潛伏感染和亞臨床患者的疾病進展風險因素是什么？亞臨床患者對結核病傳播的貢獻有多少？現有的針對自然史各階段的診斷技術存在很多不足，新技術的開發也面臨巨大挑戰。我國仍然是結核病高負擔國家，早期診斷和高危人群干預對于控制結核病非常重要。因此，我們應該加強對結核病自然史的研究，開發針對結核病不同階段的早期診斷技術，完善結核病預防干預措施，為終止結核病做出中國的貢獻。