結核病患者N-乙酰基轉移酶2編碼基因多態性檢測與異煙肼合理用藥專家共識

首都醫科大學附屬北京胸科醫院 《中國防癆雜志》編輯委員會

異煙肼(INH)作為一線抗結核藥物中單一殺菌力最強的藥物，是非異煙肼耐藥結核病治療標準方案中的首選。異煙肼在體內存在不同的代謝通路，其中最重要的通路是在N-乙酰基轉移酶2(N-acetyltransferase-2，NAT2)的作用下將其乙酰化為乙酰異煙肼。大量研究顯示，NAT2的編碼基因的基因多態性對于異煙肼的代謝速度有重要影響，由此導致服用標準劑量(5 mg/kg)異煙肼治療的患者的血藥濃度呈現明顯差異(3～7倍)[1-6]。而依據NAT2基因多態性，可將人群分為三種類型：快乙酰化型、中間乙酰化型和慢乙酰化型。2015年國家衛生和計劃生育委員會頒布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中明確推薦開展NAT2基因多態性檢測項目，以指導異煙肼的個體化用藥劑量選擇。美國食品藥品監督管理局也已將NAT2列為指導異煙肼個體化用藥的檢測指標。2017年，韓國發布的臨床用藥基因檢測指南中明確指出，在使用異煙肼進行抗結核治療時，應進行NAT2基因型檢測。盡管國內外指南均推薦進行NAT2基因型檢測以指導異煙肼的個體化用藥，但鑒于多種原因，臨床實踐中NAT2基因檢測率并不高，尚無NAT2基因多態性檢測相關的技術規范，也缺乏依據患者乙酰化類型調整異煙肼個體化用藥劑量的共識，影響了根據NAT2基因型差異調整異煙肼用量的個體化治療策略的實施。為規范中國結核病患者NAT2基因型檢測流程、科學合理地依據NAT2基因型檢測結果指導異煙肼用藥劑量的合理選擇，首都醫科大學附屬北京胸科醫院和《中國防癆雜志》編輯委員會共同組織結核病治療領域和藥理學領域的知名專家，結合現有指南及公開發表的專業文獻，經充分討論，形成本共識。

一、NAT2基因檢測的臨床意義

(一)NAT2基因多態性

NAT2基因定位于人類8號染色體8p22，編碼區全長820 bp，共編碼290個氨基酸。研究證實，NAT2基因多態性對NAT2酶的表達、穩定性，以及催化活性有重要影響。截至2016年4月18日，人類NAT2等位基因數據庫已報道了50個多態性位點(http://nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2% 20alleles_2013.htm)，可組成上百種NAT2等位基因型，并列舉了每種等位基因所屬的表型(快型或慢型)。NAT2基因主要存在7個常見的單核苷酸多態性位點，分別是191G→A、282C→T、341T→C、481C→T、590G→A、803G→A、857G→A[2]，可組成27個以上的等位基因型，其中，*4型為野生型，為正常的快代謝等位基因。191G→A為等位基因*14 各亞型共有位點，屬慢型等位基因，該位點突變在非洲人群中的頻率較高，而在亞洲人群中幾乎為零(數據來源：NCBI dbSNP數據庫，rs1801279)；341T→C為等位基因*5各亞型共有位點，屬慢型等位基因；590G→A為等位基因*6各亞型共有位點，屬慢型等位基因；857G→A為等位基因*7各亞型共有位點，屬慢型等位基因。據文獻報道，等位基因*5、*6、*7可解釋東方人群和高加索人群中98%以上的慢乙酰化代謝，*5、*6、*7在中國人群中的等位基因頻率分別為3.3%、21.2%、11.7%[3]。282位點通常與590或857位點聯合突變，分別形成等位基因*6A和*7B；341、481、803位點聯合突變形成等位基因*5B。*5B、*6A、*7B 為最常見的NAT2等位基因亞型(*5B為*5的亞型，*6A為*6的亞型，*7B為*7的亞型)，占所有突變的90%以上。由于341T→C為*5共有，590G→A為*6共有，857G→A為*7共有，而*5B、*6A、*7B是最常見的突變亞型等位基因，且341T→C與481C→T聯合突變形成*5B。因此，多數研究通過檢測341或481位點來判斷等位基因*5B或*5的存在，檢測590位點來判斷等位基因*6A或*6的存在，檢測857位點來判斷等位基因*7B或*7的存在。

鑒于NAT2基因7個常見的單核苷酸多態性位點中有一些常以連鎖形式存在，依據國內外數據報道，推薦建立NAT2基因多態性位點檢測技術時應包括191、341、590和857等4個位點，由此就能夠鑒定幾乎所有的突變類型，確定患者的NAT2基因型，判定患者的異煙肼乙酰化類型。

(二)NAT2基因多態性與異煙肼代謝的關系

注 CYP2E1：細胞色素P4502E1；GST：谷胱甘肽巰基轉移酶；NAT2：N-乙酰基轉移酶2圖1 人體內異煙肼代謝途徑[4]

異煙肼在人體內主要存在兩條代謝通路，如圖1 所示，其大部分(50%～90%)在NAT2酶的作用下乙酰化為乙酰異煙肼(AcINH)，之后在酰胺酶(amidase)的作用下生成乙酰煙肼(acetyl hydrazine，AcHz)，另有一小部分異煙肼直接由酰胺酶催化水解為酰肼(hydrazine, Hz)，已知酰肼對肝細胞有毒性作用。NAT2、細胞色素 P4502E1(CYP2E1)、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)等均參與異煙肼的代謝過程，其中，NAT2發揮決定性作用。根據攜帶等位基因的類型進行表型的劃分：攜帶2個快代謝等位基因者為快代謝型(RM)，攜帶1個快代謝等位基因和一個慢代謝等位基因者為中間代謝型(IM)，攜帶任意2個慢代謝等位基因者為慢代謝型(SM)[1]。對于快代謝型人群，異煙肼在體內代謝生成乙酰異煙肼的速度要明顯快于其他類型，也由此造成此類型人群血中異煙肼濃度明顯低于其他類型；而慢代謝人群對異煙肼乙酰化代謝速度較其他類型明顯降低，而對異煙肼的水解作用加強，導致酰肼聚集，易于引發肝功能受損等不良反應[4]。來自我國的研究數據都表明，我國人群中以中間代謝型最為常見，約占40%～50%；快代謝型次之，約占30%～35%；慢代謝型較為少見，約占15%～20%[2-6]。

充足的數據表明，NAT2基因多態性是造成不同人群服用異煙肼之后血藥濃度差異的主要原因(可解釋85%以上的差異)，而NAT2以外的異煙肼通路代謝所產生的酰肼與肝功能損傷的發生密切相關。推薦對結核病患者及時開展NAT2基因型鑒定，輔助對可能出現的低藥物濃度和可能帶來的肝臟損傷風險進行預判。

(三)NAT2基因多態性對異煙肼藥代動力學各項指標的影響

NAT2基因型對異煙肼代謝類型的影響可通過對異煙肼及其代謝產物血藥濃度的實時監測進行驗證。根據患者NAT2基因型判定的快型、中間型、慢型等三種代謝類型患者之間的異煙肼血藥濃度存在明顯差異。服用相同劑量異煙肼情況下，不同代謝類型患者間異煙肼的血藥濃度表現為快代謝型<中間代謝型<慢代謝型，而作為主要代謝產物的乙酰異煙肼的血藥濃度則呈現出相反的狀態，即快代謝型>中間代謝型>慢代謝型。由此，中間代謝型和慢代謝型患者的血中乙酰異煙肼與異煙肼比值(RA/I)要明顯低于快代謝型患者，揭示NAT2基因型對異煙肼的代謝能力有較大影響[5-9]。

由于不同NAT2基因型的人群代謝異煙肼的速率不同，不同基因型人群在服用異煙肼后的血漿藥物濃度及藥物時間-濃度曲線下面積[AUC(0-∞)]存在較大差異，總體趨勢是慢代謝型>中間代謝型>快代謝型。

(四)NAT2基因對異煙肼早期殺菌活性(early bactericidal activity，EBA)的影響

抗結核藥物EBA試驗是通過連續監測每天采集痰液中存活的結核分枝桿菌數量的變化，評估單一藥物或新治療方案對新診斷的涂陽肺結核患者的殺菌活性。EBA常作為藥物治療初期效果的評價指標之一。有研究通過設置 37.5 mg、75 mg、150 mg、300 mg、600 mg等5個劑量組研究不同劑量對異煙肼EBA的影響，結果表明：隨著劑量增加，異煙肼血藥濃度增高，異煙肼的平均EBA也相應增加，血藥濃度是影響EBA的重要因素[10]。研究還發現，服藥2 h后異煙肼血藥濃度為 2～3 mg/L時，異煙肼平均EBA最大；且在同等異煙肼劑量下，不同乙酰化代謝類型患者的平均EBA結果為慢代謝型>中間代謝型>快代謝型。

在一定范圍內，異煙肼的用量、服藥后的血藥濃度與EBA呈正相關。有必要考慮依據患者的乙酰化代謝類型適當調整異煙肼用藥劑量，使患者血藥濃度達到理想的濃度范圍，以提高療效。

(五)NAT2基因與異煙肼引發的肝損傷關系

抗結核藥物所致藥物性肝損傷是我國藥物性肝損傷常見原因之一，輕者表現為一過性轉氨酶升高，重者可致肝衰竭，甚至危及生命。大量研究顯示，NAT2慢乙酰化基因型是發生藥物性肝損傷的高危因素之一(OR值為2～5)[11-18]。而減少慢代謝型患者的異煙肼用量可以維持理想的血藥濃度并減少肝功能損傷的發生[19]。因此，慢代謝型患者較其他基因型患者更易于發生肝功能損傷，建議對接受異煙肼治療的慢代謝型患者在治療過程中密切關注各項反映肝功能的指標的變化，可嘗試依據血藥濃度適當降低異煙肼用量。

(六)依據乙酰化代謝類型調整異煙肼劑量

多項基于NAT2基因型、藥物劑型、體質量、性別等因素與異煙肼藥代動力學及藥效的研究表明，NAT2基因型自身可解釋88%的個體差異。有研究評估了依據患者NAT2基因型的不同，按照慢代謝型、中間代謝型和快代謝型者分別服用2.5 mg/kg(0.5倍標準劑量)、5 mg/kg(標準劑量)和7.5 mg/kg(1.5倍標準劑量)的異煙肼劑量，獲得了更好的治療成功率，并減少了肝功能損傷的發生[19-23]。2015年7月，國家衛生和計劃生育委員會頒布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》[1]也給出了基于NAT2基因型的異煙肼用藥指導建議，即：建議降低NAT2慢代謝型(攜帶2個慢代謝型等位基因或單倍型)個體異煙肼的用藥劑量以預防蓄積中毒和周圍神經炎；中間代謝型(攜帶1個慢代謝型等位基因和1個快代謝型等位基因)和快代謝型(具有2個快代謝型等位基因)患者可常規使用異煙肼進行治療。

綜上所述，綜合目前NAT2與異煙肼劑量研究的結果，建議對不同NAT2基因型的結核病患者參考其代謝類型進行異煙肼用量的調整，劑量應用的總體原則是快代謝型>中間代謝型>慢代謝型。在目前仍缺乏足夠的證據之前，建議根據患者乙酰化代謝類型和血藥濃度進行劑量的調整，可以目前較為公認的服藥2 h后理想的血藥濃度3～6 mg/L作為目標濃度進行劑量的調整。

二、NAT2基因檢測流程、質控及報告內容和解讀規范

(一)NAT2檢測技術基因位點的選擇

NAT2等位基因型組合有上百種，而*5B、*6A、*7B是最常見的突變亞型等位基因，占所有突變的90%以上，其代表等位基因分別為341T→C、590G→A、857G→A；其中，341T→C與481C→T聯合突變也會形成*5B，而481C→T為同義突變，不影響NAT2代謝表型，可選擇性進行檢測；282C→T通常與590G→A或857G→A聯合突變，分別形成等位基因*6A和*7B，而282C→T為同義突變，不影響NAT2代謝表型，也可選擇性進行檢測。推薦在我國使用的NAT2檢測技術的檢測位點至少應包括341T→C、590G→A和857G→A等3個位點，對于有可能在國際應用的檢測技術，建議考慮再增加191G→A位點的檢測。

(二)NAT2基因多態性檢測的適用人群

基于現有指南及公開發表的專業文獻中納入的研究人群，NAT2基因檢測適用于治療方案中包含異煙肼的結核病患者。鑒于目前NAT2基因型對兒童及特殊疾病群體異煙肼用藥的研究較少，臨床證據不充分，本指導原則不適用于兒童和特殊疾病群體等。

(三) 檢測基本流程

1.樣本采集：NAT2基因檢測對象為人基因組DNA，樣本類型可以選擇人體組織樣本、唾液、外周全血、白細胞等，推薦使用人外周靜脈血和唾液檢測。其中，全血采集量以3～5 ml為宜，使用抗凝劑進行抗凝處理；抗凝劑首選乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑或枸櫞酸鈉抗凝劑，禁止使用肝素抗凝劑。唾液樣本推薦使用具有結核分枝桿菌滅活性保存液的采集裝置進行采集，采集量以1～3 ml為宜。唾液樣本采集時，需要用舌頭刮蹭上下顎，保證脫落細胞的數量；建議采樣前30 min內勿進食、飲水、吸煙等，勿在采樣之前漱口。血液樣本在2～8 ℃可儲存7 d，不能盡早進行提取的樣本可于-20 ℃及以下長期儲存。

2.DNA提取：DNA質量是檢測成功的關鍵因素。對于不同類型標本的人基因組DNA的提取可以選用商品化的DNA提取試劑盒進行。有條件的情況下，提取的DNA建議先進行質量評估，即測定濃度和純度，之后再用于NAT2基因檢測。

3.NAT2基因的檢測：NAT2基因檢測是對人類基因組DNA 上的單核苷酸多態性進行檢測，檢測方法仍以Sanger測序法作為“金標準”[17-18]。已陸續有更加簡便、快速方法的建立和應用的報道，諸如PCR-RFLP法[2,21]、qPCR法[13]、探針熔解曲線法[8,24]，等等。實驗室可在充分了解不同檢測方法的優缺點及局限性后根據實際情況選擇應用，在使用前需對該檢測體系的敏感度、特異度、重復性和穩定性進行驗證。

4.質量控制：實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南(試行)》《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》等行業文獻和要求。檢測人員、分析人員、報告分析人員和提供咨詢人員應具備相應專業背景，且經過相應培訓取得上崗資質。實驗室區域設置和環境需要滿足實驗環節和儀器要求，檢測相關的儀器設備必須定期維護和校驗。建議NAT2檢測實驗室應建立質量管理體系，對于標本采集和處理、實驗操作、結果分析和報告分析各個環節均需要建立標準作業程序文件，實驗操作程序須經過性能驗證或確認。實驗環節需要設置陰性和陽性對照。

5.檢測報告：NAT2基因突變檢測的報告內容應包括檢測結果及對結果的詮釋，且能夠被臨床醫師理解；其他內容應涵蓋患者及標本基本信息、提取方法、檢測方法、檢測試劑及儀器、相關臨床意義，以供臨床醫師全面參考。建議從接收標本到發出報告周期不超過5個工作日，以及時滿足臨床需求。

6.檢測報告解讀：基于國外數據庫及大量的文獻報告，以推薦的341T→C、590G→A和857G→A等3個位點為例，對檢測結果及其臨床意義做以下參考建議(表1，2)；若開展的NAT2突變檢測項目涉及更多NAT2基因上的突變位點，可參考專業數據庫(http://nat.mbg.duth.gr/)進行結果的判讀，但最終的解釋需依據各類信息(包括來自群體數據庫、疾病數據庫、文獻和患者病史的信息)進行綜合評判。

表1 NAT2基因型與乙酰化代謝類型對應關系

表2 患者的乙酰化代謝類型及異煙肼用藥建議

三、總結

精準化治療是結核病化療的發展方向。在異煙肼用藥之前對患者NAT2基因型進行檢測，并以此為依據選擇個體化的異煙肼用藥劑量，減少藥物不良反應的發生，有助于提高結核病精準化治療水平。然而，關于不同NAT2基因型患者的最適異煙肼劑量，以及如何合理應用高劑量異煙肼等重要內容，目前國內外均處于研究階段，未來可能會有更詳實的數據指導更加精準的異煙肼用量選擇。構建我國大樣本NAT2基因突變數據庫并進行規范解讀，可以指導與規范NAT2基因檢測在我國的臨床應用，改善相應患者的治療策略。隨著中國人群的NAT2基因檢測項目開展，以及NAT2基因突變對療效影響的研究更加深入，對結果的解讀也將更加準確。

執筆者黃海榮、王雋、初乃惠

專家組成員(排名不分先后) 馬玙、初乃惠、黃海榮、高孟秋、段鴻飛、于霞、陸宇、馬麗萍、聶文娟、王雋(首都醫科大學附屬北京胸科醫院/北京市結核病胸部腫瘤研究所)；陳效友(首都醫科大學附屬北京地壇醫院)；王黎霞、李敬文、范永德(《中國防癆雜志》期刊社)；沙巍、范琳、顧瑾(同濟大學附屬上海市肺科醫院)；張文宏(復旦大學附屬華山醫院)；吳雪瓊、梁建琴(中國人民解放軍總醫院第八醫學中心)；曹文利(北京老年醫院)；蔡青山(杭州市紅十字會醫院)；陳曉紅(福建省福州肺科醫院)；陳裕(河南省傳染病醫院)；鄧愛花(江西省胸科醫院)；鄧國防(深圳市第三人民醫院)；杜鵑、劉冠、周銘(武漢市肺科醫院)；韓文革(山東省濰坊市第二人民醫院)；金龍(黑龍江省傳染病防治院)；李昕潔、鄺浩斌(廣州市胸科醫院)；李志惠(河北省胸科醫院)；梁瑞霞(河南省胸科醫院)；劉愛梅(廣西壯族自治區龍潭醫院)；劉玉峰(青島市中心醫院北部院區)；潘洪秋(江蘇省鎮江市第三人民醫院)；孫鵬、楊國立(吉林省結核病醫院)；王華(安徽省胸科醫院)；仵倩紅(陜西省結核病防治院)；楊坤云、易恒仲(湖南省胸科醫院/湖南省結核病防治所)；張俠(南京市第二醫院)；黨麗云、任斐(西安市胸科醫院)；石蓮(沈陽市胸科醫院)；吳春(長春市傳染病醫院)；邱超(佳木斯市腫瘤醫院)