藥物心臟毒性模型建立與評價的研究進展

毛鑫羽,黃宇虹,王保和

隨著藥物研究與開發的不斷發展,藥物的安全性問題愈來愈受到關注,藥物安全性的相關基礎研究廣泛開展。雖然大部分藥物上市后被證實安全有效,但仍有部分藥物在臨床應用的安全方面存在隱患[1]。要正視藥物的毒性,選用合適的生物毒性模型,用科學客觀的數據對藥物的毒性進行正確評價。

藥物毒性主要體現在對心、肝、腎等主要臟器的損害方面,其中藥物心臟毒性是指藥物在相對小的劑量和相對短的時間內對心臟生理功能產生影響或損害心肌的藥效反應[2]。心臟毒性反應多會導致心肌病的發生,嚴重影響心肌及心臟電生理功能[3],心臟安全性是藥物研發階段臨床應用前及上市前后需要持續考量的重要指標,如何詳細全面地評價藥物心臟安全性、正確認識藥物心臟毒性,是藥物安全性評價的重點[4]。

在廣泛開展的藥物安全性評價基礎研究中,模型的建立是進行進一步醫學試驗和假說的基礎,具有不可替代的重要意義,掌握藥物心臟毒性的臨床試驗前篩選技術,找到能夠快速、準確、敏感地反映外源性化合物對生物體毒性作用的評價模型已經成為藥物安全性評價亟待解決的重要問題[5-6]。現對藥物心臟毒性模型的建立與評價進行綜述。

1 體外模型

1.1 離體心臟 離體大鼠心臟模型已經廣泛用于心臟缺血再灌注損傷等相關研究,或應用于監測藥物對心臟功能和節律的影響等研究中。Robert[7]建立了離體大鼠心臟的短期模型,通過左室壓反映藥物的心臟毒性。1895 年德國生理學家Oscar Langendorff 首次成功制備了哺乳動物的離體心臟灌流裝置[8],命名為Langendorff 離體心臟灌流模型。K-H 灌流液經由主動脈根部灌注冠狀動脈循環,從冠狀靜脈竇流入右心房,與生理狀態下的血液灌流方向相反[9]。正常情況下,大鼠立體心臟經Langendorff 裝置灌流后數秒即可恢復自主搏動,20 min 左右心室內壓趨于穩定,心率及節律穩定,偶爾發生心律失常[10]。通過建立穩定的Langendorff 離體心臟灌流模型,應用潛在毒性藥物對其進行干預,對離體心臟的心率、PR 間期、QT 間期等心電圖指標進行記錄,觀察發生心律失常的風險,以評價藥物的心臟安全性。離體心臟灌注模型具有可重復性強、敏感性高等特點,廣泛應用于心血管領域基礎研究中,但離體心臟模型的制備受灌注液、灌注壓力、流量及灌注操作等多種主觀因素影響,不易標準化[11],且嚙齒類動物及犬等動物的心臟結構、電生理以及遺傳學相關因素與人類的差異,使其不能完全準確預測藥物對人體潛在的心臟毒性,具有一定的局限性[12-14]。

1.2 人誘導多能干細胞分化的心肌細胞 既往采用人類ether-a-go-go 相關基因(hERG)穩定轉染的HEK293 細胞系作為評價藥物心臟毒性的體外細胞模型[15],而心肌細胞由于具有部分電生理特性且操作簡便的特點,如今被廣泛應用于藥物心臟安全性評價方面。來源于人誘導多能干細胞分化的心肌細胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)表達肌絲蛋白,具有與原代心肌細胞相類似的電生理特性,并且表達多個與人心室肌細胞動作電位相關的離子通道,為藥物心臟毒性的評價提供了新的體外模型[16-18]。通過對hiPSC-CMs 的長期體外培養,可以檢測出引起藥物心臟毒性的多條可能途徑及機制,包括引起氧化應激、線粒體損傷、改變細胞內信號通路、改變Ca2+調節等[19-20]。可以通過hiPSCCMs 模型檢測藥物的心臟電生理毒性、結構性毒性等,為藥物安全性監測提供了細胞水平的模型。

干細胞誘導分化的心肌細胞在藥源性心臟毒性體外評價研究中應用廣泛。相對于原代大鼠心肌細胞,人誘導干細胞分化的心肌細胞作為藥物的心臟毒性評價模型更為準確敏感。有研究者通過對比原代大鼠心肌細胞與hiPSC-CMs 兩種細胞模型,以探尋更優的心臟毒性體外評價模型。通過應用RTCAxCELLigence技術對細胞的不規律搏動頻率或振幅進行監測,同時運用高內涵細胞成像法在給藥后多個時間點檢測線粒體膜電位,并觀察不同濃度藥物對原代大鼠心肌細胞及hiPSC-CMs 的影響,證實hiPSC-CMs 對藥物心臟毒性的評價更加敏感,在用藥早期、低濃度用藥時即可檢測到藥物對細胞的影響[21]。利用人胚胎干細胞分化的心肌細胞能夠建立一種可行的體外心臟毒性評價模型,通過聯合實時細胞分析法(real-time cell analysis cardio,RTCA Cardio)以及高內涵細胞成像技術,可連續動態記錄細胞的增殖、毒性及細胞狀態,對藥物的心臟毒性進行快速、靈敏、準確的評價,并且可以作為一種高通量篩選工具用于臨床前藥物心臟毒性早期篩選[22-24]。

hiPSC-CMs 與成熟心室肌細胞存在些許差異,主要表現在成熟度方面。hiPSC-CMs 高表達超極化激活環核苷酸門控通道及L 型鈣通道,低表達內向整流型鉀離子通道2.1(Kir2.1)及鈉通道,動作電位去極化速度較成熟心室肌細胞減慢,時間略長[25-26]。Campbell等[27]通過誘導hiPSC 產生心肌細胞、成纖維細胞及冠狀動脈內皮細胞,將這幾種細胞按照人心臟中的比例共同培養,完成了心臟立體細胞培養技術的構建。Correia 等[28]也通過一種全新的培養模式建立了高純度hiPSC-CMs 立體聚集體模型,并證實相比于平面培養的心肌細胞,立體細胞模型在細胞間相互作用等對各方面基因表達有明顯的影響,提示hiPSC-CMs 立體模型對藥物評價方面有更準確的預測及參考價值。應用人誘導多能干細胞分化獲得的心肌細胞可以減少不必要的動物實驗,同時可以高通量評價藥物對心臟功能性和結構性的影響[18],將純度更高、成熟度更高的hiPSC-CMs 及心臟立體培養技術應用于藥物的研發及早期安全性評價,可以很大程度上降低藥物研發成本,減少種屬差異,增加對藥物心臟毒性預測的敏感性與準確性,并即將成為臨床前藥物心臟安全性評價的重要體外模型[29-30]。

2 動物模型

目前,動物模型的實驗對象主要包括大鼠、小鼠、兔等,主要目的是尋求與人類結構和發病過程相似的動物模型,便于更好地進行實驗研究。現已建立了大鼠或小鼠、兔、豬、犬和斑馬魚等用于預測藥物心臟毒性的模型,這些模型已用于藥物臨床前毒性的評價。

2.1 鼠、兔 大鼠、小鼠及家兔等嚙齒類動物是當前藥物安全性評價在體模型主要用到的實驗對象,可以通過兔耳緣靜脈注射阿霉素2 mg/kg 建立早期心臟毒性模型,或通過腹腔注射阿霉素法復制大鼠心臟毒性模型,采用梯度劑量間隔給藥造模[31-33],其中張珊等[34]采用阿霉素誘導大鼠心臟毒性模型,鹽酸阿霉素2.5 mg/kg 對大鼠少量多次腹腔注射,每周1 次,累積總藥量15 mg/kg。亦有研究者通過多柔比星(DOX)4 mg/kg小鼠腹腔注射建立心臟毒性模型[35]。

通過大鼠或小鼠、兔等嚙齒類動物建立藥物體內心臟毒性模型,飼養方便,易于復制,可完成藥物在體內的吸收、分布、代謝、排泄過程,與臨床上早期藥源性心臟毒性反應相似,在藥物心臟毒性臨床前評價方面廣泛應用,對早期藥源性心臟毒性的評價具有重要意義。

2.2 斑馬魚 近年來,斑馬魚在國內外已成為一種熱門的藥學研究工具,被用來建立各種疾病模型進行藥物活性、毒性的高通量篩選以及藥物代謝等方面的研究[36-37]。

張利軍等[38]選用斑馬魚的胚胎作為實驗動物,對藥物的心臟毒性進行評價,通過高通量篩選建立藥物心臟毒性斑馬魚模型。研究以4 種已知心臟毒性陽性藥物作為試驗藥物,通過觀察斑馬魚胚胎心血管系統的形態學改變,測量靜脈竇-動脈球(SV-BA)距離及心率來評價藥物心臟毒性作用的特點,證明斑馬魚作為藥物心臟毒性評價模型的準確性及可行性。趙夢嵐等[39]選用狀態好的48hpf(hours post fertilization)斑馬魚胚胎,設立低、中、高濃度烏頭堿進行干預,并采用0.1%二甲基亞砜(DMSO)作為陰性對照,于給藥后12 h、24 h、48 h 觀察斑馬魚胚胎的存活率、生長情況以及心臟舒縮功能,記錄斑馬魚胚胎的心包水腫情況以及心率、心排血量等各項心功能指標。研究證實10 μmol/L 中等濃度劑量烏頭堿給藥48 h 后,斑馬魚胚胎心包水腫明顯,心臟舒縮功能障礙,具有明顯的心臟毒性,但不致其死亡,確立選用10 μmol/L 濃度烏頭堿干預斑馬魚胚胎建立早期心臟毒性模型,并于后續研究中應用。徐卓然等[40]運用64.4 μmol/L 阿霉素對24hpf 斑馬魚胚胎進行干預,建立斑馬魚心臟毒性模型,并對其機制進行了探討。

斑馬魚模型克服了其他模式生物在研究中的局限和弊端,具有身體透明、基因同源、快速發育、體型微小、飼養便捷等特點[41],可以通過觀察藥物對斑馬魚的作用進而預測其對人體的影響[42],使斑馬魚成為了藥物心臟毒性研究的理想動物模型。

3 心臟毒性模型的評價

心臟毒性模型建立后,其模型的評價顯得尤為重要。細胞模型主要通過應用RTCAxCELLigence 技術或高內涵成像技術檢測線粒體膜電位來評價藥物對心臟毒性的影響,對于動物模型目前主要采用以下幾個方面對心臟毒性模型的建立進行評價:①形態學觀察。斑馬魚心臟毒性模型可以通過顯微鏡以及熒光倒置顯微鏡觀察斑馬魚胚胎的狀態、心臟的形態結構、心臟收縮與舒張情況以及心包水腫情況等,對斑馬魚心臟損傷的表型進行評估[39]。②心率及心功能監測。動物模型可以對大鼠、兔或斑馬魚的心率、心排血量、每搏量、血流動力學等心功能指標進行檢測,反映藥物對心臟早期的毒性反應,更深入的研究可以通過熒光蛋白基因標記實時監控斑馬魚胚胎心臟發育過程中特定基因的表達情況及表達位置,以更準確地定性、定量對藥物的心臟毒性進行評價[40]。③超聲心動圖。通過心肌背向散射積分技術及小動物超聲儀器有效監測模型的建立,評估模型的效果,將大鼠或小鼠麻醉脫毛后,通過Vevo2100(Visual Sonics Inc)儀器對其進行心臟超聲檢查,檢測射血分數(EF)、左室縮短分數(FS)、左室壓最大上升速率(+LVdp/dtmax)以及心臟構型及血流的變化,評價藥物對心臟的毒性作用[31]。通過定量組織速度成像(QTVI)技術與小動物超聲儀器對早期藥物心臟毒性模型的建立進行評價,可以根據QTVI參數的變化來調整造模過程中的用藥劑量,使建立的藥物心臟毒性模型的病理變化程度趨于一致[43]。根據不同的心臟毒性模型,選取相應的方法對模型的建立及藥物的心臟毒性進行評價。

4 小 結

藥源性心臟毒性作為各類藥物研發及臨床應用階段需要考量的重要問題,對藥物心臟毒性的早期監測十分重要,國內外藥物毒性評價研究迅速發展,選取與人類心臟毒性反應相似的動物或細胞模型,建立適合的藥物心臟毒性評價模型,對藥物的心臟安全性評價具有重要的意義。

離體心臟模型可以清晰敏感地模擬藥物對心臟的毒性,易于觀察及早期發現,但造模復雜、受操作影響不易標準化,實驗動物心臟結構及電生理功能與人體相較有一定的差異;hiPSC-CMs 建立早期心臟毒性模型與人類心肌細胞具有相似的電生理特性,敏感性高,有利于高通量早期評價藥物的心臟毒性,且立體細胞模型對于評價藥物心臟毒性可能更加準確,成熟度方面有待進一步提高;嚙齒類動物心臟毒性模型建立簡便,飼養方便,可以運用超聲心動圖對模型的建立進行評價,并可以通過測量結果調整造模過程中的用藥劑量;斑馬魚作為一種與人類基因同源的動物,體型較小,身體透明,復制方便,建立藥物心臟毒性模型,可以直觀地對心臟結構形態、舒縮狀態等情況進行觀察,實時監測藥物對斑馬魚心率及心功能的影響,進而預測藥物對人體心臟安全性的影響,是較理想的心臟毒性模型動物。根據心臟安全性評價需求,選取并建立合適的心臟毒性模型可以為新藥研發及藥物早期臨床應用方面的進一步研究提供科學依據與思路。