補腎生髓強骨方對酒精性股骨頭壞死模型大鼠炎癥因子、氧化應激及TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達的影響*

馬秉楠 關玉波 陳長鋒 于 洋 徐西林 張曉峰△

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省齊齊哈爾市中醫醫院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

股骨頭壞死發病與激素、酒精、輻射、血液系統疾病、血管源性疾病等多種因素有關［1］。酒精性股骨頭壞死多發于中青年人群，由于乙醇過量的攝入而導致，與乙醇細胞毒性、脂肪代謝紊亂、骨質疏松等多種因素有關，骨內微循環障礙是其病理基礎［2］。toll樣受體4（TLR4）在多種疾病發展過程中發揮啟動炎性反應的作用，核因子-κB（NF-κB）可通過介導血管內皮細胞損傷發揮促凝血作用，且TLR4可通過激活NF-κB信號傳導途徑促進細胞因子的合成和釋放，血管內皮生長因子（VEGF）具有促進血管生長促進局部組織供血的作用［3-4］。股骨頭壞死屬中醫學“骨痹”“痰濁”“骨蝕”范疇，嗜酒無度損傷脾胃，導致脾失健運，肝失疏泄，濕熱內蘊，痰濁郁結，瘀血阻滯［5］。治法為活血化瘀、通絡止痛、強腎壯骨。補腎生髓強骨方為黑龍江中醫藥大學聯合齊齊哈爾市中醫醫院聯合開發的治療酒精性股骨頭壞死的經典方劑，具有化瘀行氣、補肝益腎、強筋健骨功效，具有良好的臨床療效，但其作用機制尚不明確。本研究旨在觀察補腎生髓強骨方對酒精性股骨頭壞死模型大鼠炎癥因子、氧化應激及TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達的影響，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠，雄性，12周齡，體質量（240±20）g，由黑龍江中醫藥大學動物中心提供，許可證號：SYXK（黑）2017-0009。實驗動物合格號：2019110367。動物室溫飼養，自然采光，自由飲水，適應性飼養7 d后進行實驗研究。

1.2 試藥與儀器 補腎生髓強骨方：熟地黃20 g，骨碎補25 g，牛膝15 g，當歸15 g，雞血藤15 g，三七10 g，紅花10 g，杜仲15 g，續斷10 g，菟絲子20 g，黃芪10 g，獨活10 g，甘草10 g。上述中藥飲片由齊齊哈爾市中醫醫院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，分別濃縮至1 mL含1 g原藥材的藥液。多巴絲肼片（美多芭），上海羅氏制藥有限公司；52°白酒產自北京紅星股份有限公司；水合氯醛購于國藥集團化學試劑有限公司；HE染色試劑盒購于武漢阿斯本生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和C反應蛋白（CRP）試劑盒購于碧云天生物科技有限公司（批號分別為 190564、191123、200046）；脂質過氧化物（LPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒購于福建邁新生物科技有限公司（批號分別為20190812、20190923、20191116）；TLR4、NF-κB和VEGF引物由上海佰力格生物技術有限公司合成，其序列見表1；SPARKeasy提取試劑盒、SPARKscriptⅡ RT kit、SYBR Green qPCR Mix均購于山東思科捷生物技術有限公司（批號分別為：AC0101、AG0304、AH0104）TLR4、NF-κB和VEGF單抗購于武漢阿斯本生物技術有限公司（批號分別為20190622、20190711、20190515）；二抗購于河北博海生物工程開發有限公司（批號20191025）。手術器械，蘇州六六視覺醫療設備公司；BX60顯微鏡，日本Olympus Optical公司；切片機，德國萊卡公司；Neofuga23R離心機。上海力康醫療設備有限公司；EL×800酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；AU400型全自動生化分析儀，日本OLYMPUS公司；Image-pro plus 6.0病理圖像分析系統，美國Motic公司。

表1 TLR4、NF-κB、VEGF及β-actin引物序列

1.3 模型制備 采用烈性白酒灌胃法誘導建立酒精性股骨頭壞死大鼠模型［6］。將40只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組及干預組和陽性組，每組10只。除對照組外，其余大鼠給予白酒灌胃，劑量為10 mL/kg，每天灌胃1次，連續灌胃24周。對照組給予生理鹽水灌胃，劑量為10 mL/kg，每天灌胃1次，連續灌胃24周。造模成功標準為病理切片部分股骨頭出現股骨頭負重區軟骨壞死脫落。

1.4 給藥方法 于造模成功后第2天進行藥物治療。模型組和對照組給予生理鹽水灌胃，干預組給予補腎生髓強骨湯灌胃，陽性組給予美多芭灌胃（0.1 g/mL），劑量均為10 mL/kg，每日1次，連續給藥4周。

1.5 標本采集與檢測 1）HE染色：取各組股骨頭，制成0.5 cm×0.5 cm×0.4 cm的骨塊，置10%乙二胺四乙酸的染缸中脫鈣8周，每周更換乙二胺四乙酸溶液，脫鈣后經不同濃度乙醇脫水處理，二甲苯固定，連續切0.6 μm薄片，乙醇水化，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，浸入伊紅染液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察。2）炎癥因子檢測：眼球取血，離心，取上清，ELISA測定各組大鼠血清TNF-α、IL-6和CRP水平，嚴格按照說明書操作。3）氧化應激指標檢測：生物化學法檢測LPO、MDA、SOD和GSHPX等氧化應激指標。乳過氧化物酶法測定LPO，硫代巴比妥酸法測定MDA，黃嘌呤氧化酶法測定SOD，二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-PX。4）RT-PCR法檢測基因：處死各組大鼠后，取股骨頭組織，Trizol法提取總RNA，260 nm和280 nm波長檢測提取的RNA純度。擴增條件為預變性：95℃30 s，循環1次。PCR反應：95℃，5 s，60℃，30 s，循環40次。融解曲線分析：95 ℃，15 s，60 ℃ 60 s，95℃ 15 s，循環1次。測定每組mRNA的Ct值，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。5）免疫印記法檢測蛋白：取股骨頭切片，液氮磨組織，加入裂解液和PMSF混合液冰上裂解取上清，BCA法測定各孔吸光度，沸水浴變性蛋白，冷卻，加入SDS-PAGE膠，70 V恒壓電泳30 min。取PVDF膜，甲醇浸泡10 min，安裝閉合夾子，置轉膜槽，100 V電壓220 mA轉模2 h。將PVDF膜浸泡于5%脫脂牛奶TBST緩沖液，室溫水平搖床振搖1 h，棄去封閉液，TBST洗滌3次，加入一抗（1∶500），4℃水平搖床過夜。TBST洗滌3次，加入二抗（1∶2 000）、室溫孵育1 h，加入發光液，化學發光成像儀曝光后分析條帶灰度值，用Image J軟件計算目的蛋白條帶與內參蛋白條帶的灰度比值，兩者的比值即為目的蛋白的表達水平。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計數資料以百分率（%）表示，應用χ2檢驗；計量資料以（）表示，采用t檢驗比較組內和組間差異。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組骨組織的病理學比較 與對照組比較，模型組股骨頭組織結構紊亂，軟骨脫落，骨細胞陷窩，脂肪細胞體積增大；干預組和陽性組股骨頭組織結構改善，軟骨少量脫落，骨細胞陷窩減輕，脂肪細胞體積增大不明顯，且干預組優于模型組。見圖1。

2.2 各組炎癥因子水平比較 見表1。與對照組比較，模型組TNF-α、IL-6和CRP水平顯著升高；與模型組比較，干預組和陽性組血清TNF-α、IL-6和CRP水平顯著降低，且干預組低于陽性組（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠骨組織病理切片（HE染色，200倍）

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較（±s）

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與陽性組比較，▲P＜0.05。下同

組 別n TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）CRP（mg/L）對照組模型組干預組陽性組10 10 10 10 21.03±2.31 37.23±3.45*24.57±2.38*△▲26.47±2.34*△69.54±4.12 93.01±3.68*75.17±3.04*△▲78.01±2.89*△5.18±0.99 9.64±1.62*6.03±1.14*△▲6.53±2.89*△

2.3 各組氧化應激指標水平比較 見表2。與對照組比較，模型組LPO、MDA、SOD和GSH-PX水平均顯著升高；與模型組比較，干預組和陽性組LPO、MDA水平降低，SOD和GSH-PX水平升高，且干預組優于模型組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠氧化應激指標水平比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應激指標水平比較（±s）

組別對照組模型組干預組陽性組n 10 10 10 10 LPO（μg/L）8.23±0.61 17.34±1.32*10.35±1.15*△▲11.86±1.61*△MDA（U/L）2.31±0.28 6.42±0.37*4.39±0.42*△▲5.17±0.37*△SOD（U/L）60.14±5.23 92.31±7.36*143.48±11.34*△▲135.47±12.05*△GSH-PX（U/L）43.67±2.61 145.56±10.24*186.54±15.27*△▲171.22±15.02*△

2.4 各組mRNA基因水平比較 見表3。與對照組比較，模型組TLR4、NF-κB mRNA表達水平升高，VEGF mRNA表達水平降低；與模型組比較，干預組和陽性組TLR4、NF-κB mRNA表達水平降低，VEGF mRNA表達水平升高，且干預組優于陽性組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF mRNA水平比較（±s）

表3 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF mRNA水平比較（±s）

組別對照組模型組干預組陽性組n 10 10 10 10 TLR4 0.98±0.12 4.76±0.53*2.17±0.23*△▲2.51±0.29*△NF-κB 1.03±0.13 4.16±0.25*1.76±0.21*△▲2.01±0.23*△VEGF 1.15±0.09 0.47±0.05*0.87±0.09*△▲0.76±0.06*△

2.5 各組蛋白水平比較 見圖2，表4。與對照組比較，模型組TLR4、NF-κB蛋白表達水平升高，VEGF蛋白表達水平降低；與模型組比較，干預組和陽性組TLR4、NF-κB蛋白表達水平降低，VEGF蛋白表達水平升高，且干預組優于陽性組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠股骨頭組織中TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達

表4 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF蛋白水平比較（±s）

組別對照組模型組干預組陽性組n 10 10 10 10 TLR4 0.75±0.05 2.76±0.33*1.26±0.14*△1.47±0.12*△NF-κB 0.62±0.5 1.59±0.12*1.06±0.09*△1.19±0.12*△VEGF 4.36±0.31 2.86±0.25*3.95±0.35*△3.51±0.26*△

3 討 論

現代研究發現，酒精濫用可誘導IL-6等炎癥介質的分泌，造成免疫功能紊亂。Toll樣受體是炎癥反應的起點，可影響免疫與炎癥反應，TLR4過度表達導致破骨細胞的大量增殖［7］。NF-κB通過轉錄水平來調控基因的表達，在免疫炎性反應等方面發揮作用，導致骨骼發育減弱［8］。VEGF可刺激血管生成和促進骨形成及其改建，局部骨組織的缺氧狀態為VEGF基因發揮生物作用的關鍵誘發因素，增加VEGF的表達有助于骺軟骨的修復［9］。因此，從TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達水平探討酒精性股骨頭壞死的機制具有重要意義。

中醫學認為，腎陰不足，腎水虧乏，不能制火，熱伐其精，髓減則骨枯，阻塞經絡，筋骨失養而發此病。現代藥理研究表明，活血化瘀藥物能抑制血小板聚集、抗血栓形成、降低血液黏度［10］。補腎生髓強骨方中熟地黃可補肝益腎、強健筋骨；骨碎補、杜仲和續斷均可補肝腎、強筋骨；牛膝補益肝腎、強壯筋骨、活血祛瘀；當歸補氣和血、調經止痛；雞血藤祛風活血、舒筋活絡；三七止血散瘀、消腫止痛；紅花活血化瘀、通絡止痛；菟絲子補肝腎、益精壯陽；黃芪補氣固表、利水消腫、消毒生肌；獨活祛風除濕、痛痹止痛；甘草補脾益氣、調和諸藥。該方以破瘀通經、補益肝腎的藥為主，輔以補氣血、醒脾和胃以扶正氣，佐以活血引經的使藥，配以使藥調和諸藥，君臣佐使一起發揮止痛行氣、通經絡、滋補肝腎、壯筋骨的作用。

本研究發現，補腎生髓強骨方可改善股骨頭組織結構，減少軟骨脫落，減輕骨細胞陷窩和脂肪細胞體積，降低血清TNF-α、IL-6、CRP、LPO、MDA水平，升高SOD和GSH-PX水平，降低TLR4、NF-κB基因和蛋白表達水平，升高VEGF基因和蛋白表達水平。這與方中熟地黃改善小鼠血脂代謝；骨碎補刺激骨關節軟骨細胞代償性增生，改善軟骨細胞、推遲細胞退行性變；牛膝可通過提高血清中血管內皮生長因子的表達水平促進股骨頭壞死的修復；當歸抑制血小板的聚集，提高纖溶酶的活性，促進纖維蛋白溶解；雞血藤主要含有黃酮類、酚類、三萜及甾醇等類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、擴張血管、調節免疫等多種藥理作用；三七總皂苷能改善缺血性壞死股骨頭的成骨細胞代謝及促進血管再生；紅花中含有紅花黃色素，該物質可以抑制血液中血小板聚集，預防股骨頭壞死患者微血栓形成；杜仲調節細胞免疫平衡；續斷促進骨的形成作用，續斷能改善微循環，加快血腫吸收，促進軟骨細胞增生及膠原蛋白的合成等有關［11-16］。

綜上所述，補腎生髓強骨方對酒精性股骨頭壞死模型大鼠具有較好的治療作用，可減輕炎癥因子，改善氧化應激，其機制可能與抑制TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達有關。