CLIC3在胰腺癌中的表達及預后相關性的生物信息學分析

龔治忠 李清月 劉 剛

胰腺癌（PAAD）是一種常見的消化系統腫瘤，惡性程度極高，該疾病發病早期較為隱匿且缺乏特異性臨床癥狀，后期治療效果往往不佳，5 年生存率小于6%，且預后較差。目前，對PAAD的發生、發展機制尚不清楚，流行病學研究表明發病具有明顯的性別特征和年齡特征，發病人群以中老年男性為主[1]。

胞內氯離子通道蛋白3（CLIC3）是細胞膜和細胞器質膜上的一類能夠轉運氯離子的通道蛋白，CLIC3 通過介導氯離子及水的外流來調節細胞體積和形態，進而調控細胞的分化、遷移及凋亡等行為[2]。研究表明，CLIC3 在腫瘤細胞中均發生了不同程度的異常表達，與腫瘤細胞的增殖、周期、轉移和預后密切相關，能夠作為腫瘤發生、發展及惡性進展的潛在標志基因，此外，CLIC3 蛋白表達水平決定了患者預后情況，具有重要的臨床意義[3]。本研究擬利用GEPIA、Ualcan和HPA等數據庫，采用生物信息學的方法，探討CLIC3 在PAAD中表達情況，分析CLIC3 與PAAD患者的年齡、性別和病理組織學分級之間的關系，同時分析與PAAD患者預后的相關性，以期為PAAD的早期診斷和治療提供理論依據。

1 數據收集與分析方法

1.1 CLIC3 差異表達分析 利用GEPIA數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）分析CLIC3在PAAD組織中的表達水平，搜索條件如下：Gene=CLIC3，│Log2FC│cutoff=1，p value cutoff =0.01，Dataset selection = PAAD，Log Scale = yes，Matched Normal data = Match TCGA normal and GTEx data。搜索到的樣本總數為350例，其中PAAD患者179例，正常人群171例。CLIC3與PAAD分期、性別、年齡間的關系利用UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）分 析 完 成。利用蛋白組HPA數據庫（https://www.Proteinatlas.org），分析CLIC3在PAAD中的蛋白表達情況。

1.2 CLIC3 的預后分析和無病生存期分析 利用GEPIA數據庫，采用log-rank檢驗，運用Kaplan-Meier進行PAAD預后分析（Overall Survival）和無病生存期分析（Disease Free Survival）。參數設置如下：Gene=CLIC3，Methods = Overall Survival，Group Cutoff = Median，Hazards Ratio (HR) =yes，95% Confidence Interval = no，Axis Units =Month，Datasets Selection = PAAD。預后生存期的樣本總數為107 例，其中CLIC3 高表達患者為36例，低表達的患者為71 例；無病生存期的樣本總數為178 例，其中CLIC3 高、低表達的患者各89 例。

1.3 CLIC3 協同表達分析和甲基化分析 利用UALCAN數據庫，采用Pearson相關性分析PAAD中與CLIC3 協同表達相關系數較高的基因，分析其與CLIC3 之間的協同表達關系。利用UALCAN數據庫，分析正常組織與PAAD組織之間、各個不同病理分級之間的甲基化差異性。

2 結 果

2.1 CLIC3 在PAAD中 的mRNA及 蛋 白 表 達 分析 通過對GEPIA數據庫分析350 例樣本，其中179 例為PAAD患者、171 例為正常個體，結果表明，PAAD組織中的CLIC3表達水平高于正常組織，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1A。在HPA蛋白表達模塊中查看FKBP10 的表達情況，通過芯片分析，CLIC3在PADD中的蛋白高表達和低表達情況，可以發現核分級越高，CLIC3 表達越高，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1B。

2.2 CLIC3 與臨床特征的相關性分析 利用UALCAN數據庫，分別按照年齡、性別和病理組織學分級等因素分析PAAD組織和正常組織中CLIC3 的表達情況。病理組織學分級分析結果表明，正 常vs.3 級、1 級vs.2 級、1 級vs.3 級、3 級vs.4 級差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2A）；年齡分析結果表明正常vs.年齡（41～60 歲）、正常vs.年齡（61～80 歲）之間差異具有顯著性，發病年齡以中老年患者為主（P＜0.05）（圖2B）；性別分析結果表明，PAAD具有明顯的性別偏好性，男性患者明顯多于女性患者（P＜0.05）（圖2C）。

圖1 CLIC3在PAAD中的mRNA及蛋白表達情況

圖2 不同病理組織學分級、年齡、性別中PAAD癌中CLIC3表達差異分析（＊P＜0.05）

2.3 CLIC3 與PAAD預后、無病生存期的關系 預后分析和無病生存期利用GEPIA數據庫進行分析，以CLIC3 表達值的中位值分為高、低兩組，采用log-rank檢驗，運用Kaplan-Meier繪制生存曲線。預后分析共107 例，分析結果表明，CLIC3 高表達組（36 例）的生存期低于低表達組（71 例），且兩者差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖3A。無病生存期共分析了178 例，結果顯示CLIC3高表達組（89 例）患者無病生存期低于低表達組（89 例），差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖3B，與預后分析結果類似。

2.4 協同表達分析 協同表達分析表明，在PAAD組 織 中，CLIC3 與MMP28、TRIM29 具 有 顯著的協同表達情況，且存在明顯的正相關性，其R值分別為0.65、0.64，見圖4。

2.5 甲基化分析 利用UALCAN數據庫，對PAAD中的CLIC3 甲基化分析表明，正常組織（10例）與PAAD組織（182 例）之間差異具有統計學意義（P＜0.05），圖5A；正常組織（3 例）與1 級（2 例）、4 級（4 例）之間存在顯著性差異，而與2級（145 例）、3 級（3 例）之間不存在差異性（圖5B）；性別分析結果表明，正常組織（10 例）與男性（102 例）、女性（82 例）之間差異均存在統計學意義（P＜0.05），見圖5C。

圖3 CLIC3表達水平與PAAD患者生存期的關系

圖4 CLIC3基因與MMP28,TRIM29的相關性分析

圖5 PAAD中CLIC3甲基化分析（＊P＜0.05）

3 討 論

PAAD惡性程度極高，診斷和治療都很困難，且預后極差，嚴重威脅著生命健康[4]。目前依靠早發現、早治療。由于早期PAAD癥狀較為隱匿，給PAAD的診斷和治療帶來了很大困難。近年來，分子生物標記和生物信息學分析為PAAD的早期診斷和治療提供了新的契機。CLIC3是一類與腫瘤發生密切相關的氯離子通道蛋白，研究表明，CLIC3在胃癌、唾液腺黏液表皮樣癌等腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織[5]。本研究結果顯示，CLIC3在PAAD組織中的表達水平高于正常組織（P＜0.05），提示CLIC3與PAAD的發生關系密切。

通過對CLIC3 分析結果表明，CLIC3 在41-60Yrs和61-80Yrs中表達具有顯著性，男性患者明顯多于女性患者，這與PAAD臨床結果分析相吻合。生物信息學分析發現，健康對照組中的CLIC3表達水平與PAAD Grande 3 級之間具有顯著差異性，而與其他各組之間的差異無統計學意義，說明CLIC3 的表達水平并沒有隨著PAAD的分期的提高而表達增高，更可能是在Grande 3 級表達異常增高。研究發現，CLIC3 表達水平與腫瘤轉移及患者預后密切相關，CLIC3 高表達組的預后分析和無病生存期的總生存期明顯低于低表達組，與其他腫瘤相似[6]。DNA甲基化是腫瘤的重要生物標記物，對腫瘤患者的早期診斷和疾病監測具有重要意義。研究表明，CLIC3 可能會起到類癌基因的作用，即CLIC3的低甲基化能夠影響啟動子異常，進而導致某些蛋白的異常表達。本研究發現CLIC3在PAAD與正常組織之間，男性與女性之間均存在顯著性差異，推測CLIC3在PAAD的發生、發展過程中發揮重要作用[6]。與CLIC3正相關性最高的基因為MMP28、TRIM29，TRIM蛋白激活TRIM29-P53-Wnt信號通路，而該信號通路與腫瘤的發生、發展密切相關[7]；而MMP28在維持細胞內環境的穩態起關鍵作用，也在腫瘤發生中起重要的作用。

生物信息學分析能夠對PAAD的診斷發揮不可替代的作用。本研究通過Ualcan和GEPIA數據庫研究表明，CLIC3 在PAAD中高表達并與預后密切相關，能夠影響PAAD的發生和發展，因此CLIC3對于PAAD可能具有重要的臨床意義，將有望成為PAAD的診斷的重要生物標志物以及治療靶標。