miR-221/ 222 靶向抑制對三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細胞順鉑敏感性的影響

葉惠榮 袁惠玲 曹 茵 王西躍 吳麗華 陳桂林 陳麗娟 張玉娟

廣東省東莞市人民醫院乳腺科，廣東東莞 523000

微RNA（miR）-221/222 定位于人染色體Xp11.3[1]，兩者核心種子序列（68～72）完全同源，同時抑制miR-221/222 可抑制乳腺癌[2-3]、膠質瘤[4-5]等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。研究顯示[6]，耐藥乳腺癌組織中miR-221/222 表達上調，但抑制miR-221/222 是否可增加三陰性乳腺癌（TNBC）的鉑類藥物敏感性目前較少見報道。鑒于此，本研究觀察了抑制miR-221/222 對TNBC MDA-MB-231 細胞順鉑（DDP）敏感性的影響，現將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

細胞株：TNBC MDA-MB-231 細胞購自美國模式菌種收集中心（ATCC）細胞庫，編號：TCHU202，第2 代細胞。

試劑：miR-221 抑制劑、miR-222 抑制劑和miR-221/222 抑制劑（上海吉瑪制藥技術有限公司，貨號：B05001）；MTT 檢測試劑盒（美國Trevigen 公司，貨號：4890-25-01）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒（大連美侖生物技術有限公司，貨號：MA0220）；Caspase-9、Bax、Bcl-2 一抗（美國Imgenex 公司，IMG-5709）。

儀器：GENios 多功能酶標儀（瑞士TECAN 公司）；7900HT 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI 公司）；E10001 電泳槽（美國Invitrogen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組和轉染 取對數生長期的MDA-MB-231 細胞，將其隨機分為對照組、miR-221 抑制組、miR-222 抑制組和miR-221/222 抑制組，分別轉染空白試劑、miR-221 抑制劑、miR-222 抑制劑和miR-221/222 抑制劑，轉染后均給予DDP 5 μg/mL 進行細胞培養[7]。

1.2.2 熒光定量PCR 檢測miR-221/222 mRNA 相對表達量 轉染后24 h 時用Trizol 提取各組細胞的總RNA，采用熒光定量PCR 法檢測各組MDA-MB-231細胞中miR-221/222 mRNA 的相對表達量，miR-221上 游：3’-ACACTCCAGCTGGGACCTTGGCATACA -ATGT-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCT-5’；miR-222 上游：3’-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTA-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCAG-5’；以U6 為內參（上游：3’-CTCGCTTCGGCAGCACA-5’，下游：3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’），逆轉錄反應操作均按照Takara036A（mRNA）/037A（micro RNA）公司逆轉錄試劑盒說明書進行，反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）5.0 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×） 0.2 μL，DNA 模板（上述逆轉錄產物）1.0 μL，dH2O 2.8 μL，Total 10.0 μL，反應體系20.0 μL，擴增條件37℃15 min，85℃5 s，4℃1 min，共40 個循環，反應終止后，將樣本取出，-80℃冰箱內保存備用。采用2-ΔΔCt法分析計算[8]。

1.2.3 MTT 法檢測細增殖抑制率 轉染后24、48 h 時取各組細胞，采用MTT 法檢測各組細胞吸光度（OD490）值，將孔板進行染色，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），常規培養4 h 棄孔內液體，每孔加入150 μL DMSO 溶解，搖床10 min 混勻，490 nm 波長在酶聯免疫檢測儀上測各孔的OD 值，實驗重復3 次，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=（1-處理組A/對照組A）×100%[9]。

1.2.4 Annexin V-FTTC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率轉染后24、48 h 時取各組生長狀態良好、密度在85%以上、貼壁完好的細胞，常規6 孔板接種，CO2培養箱37℃培養24 h，棄培養液，PBS 洗滌，0.25%胰酶消化細胞后加完全培養基，離心棄上清，PBS 重懸計數，離心棄上清，加Binding Buffer 懸浮細胞，加入V-FTTC 5 μL、PI 10 μL 避光5 min 以上后，進行流式細胞檢測[10]。

1.2.5 蛋白質印跡法檢查凋亡相關蛋白表達水平 轉染后48 h 時取各組細胞，裂解后采用蛋白質印跡法檢測各組Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達水平：PBS清洗細胞，加RI-PA 進行裂解，蛋白電泳后濕轉法轉移蛋白至PVDF 膜，加Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白抗體4℃孵育過夜，TBST 洗滌后孵育二抗，隨后化學發光成像儀顯影。以GAPDH 為內參，計算相對表達量[11]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析進行檢驗，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組miR-221/222 mRNA 相對表達量比較

各組間miR-221、miR-222 mRNA 相對表達量比較，差異均有統計學意義（P ＜0.05）；進一步兩兩分析顯示，miR-221 抑制組miR-221 mRNA 表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；miR-222 抑制組miR-221 mRNA 表達水平高于miR-221 抑制組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；miR-221/222 抑制組miR-221 mRNA 表達水平低于miR-222 抑制組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。miR-221 抑制組與對照組miR-222 mRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；miR-222 抑制組和miR-221/222 抑制組miR-222 mRNA 表達水平低于miR-221 抑制組和對照組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 各組miR-221/222 mRNA 相對表達量比較（，n=6）

表1 各組miR-221/222 mRNA 相對表達量比較（，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

2.2 各組細胞增殖抑制率比較

各組轉染后24、48 h 的細胞增殖抑制率比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；進一步兩兩比較顯示，miR-221 抑制組與對照組轉染后24、48 h 的細胞增殖抑制率比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉染后24、48 h細胞增殖抑制率比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉染后24、48 h 細胞增殖抑制率高于其余三組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較（%，，n=6）

表2 各組細胞增殖抑制率比較（%，，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

2.3 各組細胞凋亡情況比較

各組轉染后24、48 h 的細胞凋亡率比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；miR-221 抑制組與對照組轉染后24、48 h 細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉染后24、48 h 細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉染后24、48 h 細胞凋亡率高于其余三組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表3。

2.4 各組細胞凋亡相關蛋白相對表達水平比較

轉染后48 h，各組間Caspase-9、Bcl-2 和Bax 表達水平比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；進一步兩兩比較，miR-221 抑制組與對照組轉染后48 h的細胞凋亡蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉染后48 h 的細胞凋亡蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉染后48 h 的Caspase-9 和Bax 水平高于其余三組，Bcl-2水平低于其余三組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表4、圖1。

表3 各組細胞凋亡情況比較（%，，n=6）

表3 各組細胞凋亡情況比較（%，，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

表4 各組細胞凋亡相關蛋白相對表達水平比較（，n=6）

表4 各組細胞凋亡相關蛋白相對表達水平比較（，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

圖1 蛋白質印跡法檢查凋亡相關蛋白相對表達水平

3 討論

乳腺癌是導致全球女性癌癥相關死亡的重要因素，雖然手術為主的綜合治療方式取得了進展，患者5 年和10 年生存率不斷提高，但復發和轉移仍是影響乳腺癌患者10 年生存率不高的重大挑戰，癌細胞對化療的耐藥性是導致乳腺癌復發和轉移的主要原因之一。TNBC 是雌激素受體（ER）陰性、孕激素受體陰性和人類表皮生長因子受體2 陰性為免疫組化特征的乳腺癌亞型，占乳腺癌總數的10%～20%。與其他亞型比較，TNBC 惡性程度高、侵襲性強、預后較差，因為缺乏激素治療的典型靶向受體，鉑類藥物是治療TNBC 的常用化療藥物。DDP 是治療TNBC 的常用化療藥物，DDP 耐藥是導致TNBC 化療失敗的重要因素[12-15]。DDP 誘發腫瘤細胞DNA 損傷和細胞凋亡的同時，能激活DNA 修復系統，誘導核苷酸的切除修復和同源重組，進而導致細胞對DDP 產生耐藥性，降低DNA 修復能力可增加腫瘤細胞的DDP 敏感性[16-19]。

TNBC 對鉑類化療的敏感性與基因組不穩定性之間存在相關性。miRNAs 是一類非編碼的小RNA，參與包括腫瘤在內的多種生物學過程，通過3’非翻譯區（3’UTR）堿基配對抑制靶基因mRNAs 的基因翻譯和/或切割調控靶基因的表達，促進腫瘤的進展和耐藥。miR-221/222 是位于X 染色體的miRNA 簇，既往研究顯示[20]，miR-221/222 在前列腺癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達，并發揮癌基因的作用。近年來的研究顯示[21]，miR-221/222 除扮演癌基因角色外，還可影響腫瘤的耐藥性。有研究顯示，在腦膠質瘤中單純抑制miR-221 可增加卡莫司汀的耐藥性[22-24]，乳腺癌MCF7 細胞單純轉染miR-221 后導致對選擇性ER 下調劑氟維司群的耐藥性增加[25]。但miR-221/222 與TNBC DDP 耐藥的研究鮮見報道，尚需要進一步研究探討。為了探討miR-221/222 與TNBC DDP 耐藥的關系，本研究采用熒光定量PCR 法檢測了miR-221/222轉染后DDP 培養的MDA-MB-231 細胞中miR-221和miR-222 的表達，結果顯示，通過抑制miR-221、miR-222 及共抑制miR-221/22 后，MDA-MB-231 細胞中相應的miR-221/222 mRNA 表達減少，但單純抑制miR-221 和miR-222 并未明顯改變MDA-MB-231 細胞的增殖率和凋亡率，而共抑制miR-221/222可明顯降低細胞的增殖率和凋亡率，蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白進一步證實了上述結果。本研究結果顯示，miR-221/222 可促進TNBC MDA-MB-231 細胞對DDP 的耐藥性，抑制miR-221/222 可增加MDAMB-231 細胞對DDP 的敏感性。

綜上所述，本研究結果顯示，miR-221/222 可調控TNBC 細胞的DDP 耐藥性，為DDP 聯合小分子非編碼RNA 治療TNBC 提供了新的研究方向。