植物乳桿菌BLPS-9中試發酵工藝優化及凍干保護劑篩選

辛國芹， 汪祥燕， 孟凡進， 寧慧宇， 徐海燕*， 谷巍

（1.山東省動物微生態制劑重點實驗室，山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000；2.壽光市文家街道畜牧獸醫工作站，山東壽光 262712）

乳酸菌是一種安全、優質、高效的益生菌，具有良好的生物學特性，可以調節動物腸道菌群平衡，增強免疫力，促進動物生長發育，提高飼料轉化率，并具有改善飼養環境和環境污染的獨特作用。我國農業部第1126號公告中允許使用的飼料微生物添加劑有16種，其中乳酸菌有11種，占68%左右（汪孟娟等，2014）。目前應用于飼料添加劑的乳酸菌主要有植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌等（Predigon，2013；趙紅霞等，2013）。高密度培養是近幾年來發酵工藝的重要目標與方向之一，細胞高密度培養（HCDF）是指在一定的培養條件和體系內，在不影響胞內產物積累的基礎上，盡可能多的積累生物量（鄭雙鳳等，2017），乳酸菌要通過高密度培養技術達到理想的高濃度產量，需要優化一系列相關的工藝參數來對發酵過程進行嚴格的控制。除此之外，乳酸菌發酵液后處理工藝也是乳酸菌菌粉制備的重要一環，如果離心條件掌握不當，菌體死亡率和損失率會隨之增高，故而選用合適的離心條件是非常必要的（白景隆，2006），諸多菌粉制作技術中，真空冷凍干燥法生產的發酵劑由于具有含活菌數高、發酵活力強、遺傳性穩定、便于儲藏、攜帶方便、使用安全等優點而被廣泛使用（喬發東等，1998）。凍干保護劑是凍干工藝過程中最為關鍵的因素之一，其不僅影響菌粉在凍干過程中的細胞存活率，也影響保藏期間的細胞穩定性（張英華等，2005），所以凍干保護劑的篩選是采用凍干法制備高活菌數乳酸菌制品研究的技術關鍵（陳聲明等，1996）。

乳酸菌產品效果優異，安全性高，在市場中廣受好評，但是儲存過程存活率下降迅速的問題一直困擾著廣大用戶，本研究在現有乳酸菌生產工藝的基礎上，通過對植物乳桿菌發酵過程中轉速、發酵溫度、發酵液pH調控、發酵時間、凍干保護劑等方面進行中試優化，從技術和經濟角度提高乳酸菌發酵液及菌粉活菌數，同時簡化操作步驟、降低各類含乳酸菌產品的成本、增強產品穩定性，為其實現工業化、研制動物微生態制劑產品奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 植物乳桿菌BLPS-9，由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.2 培養基 TM：糖蜜1.0%、葡萄糖1.0%、檸檬酸三銨0.2%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏 1.0%、吐溫 80 0.1%，pH 6.5。

1.3 試驗器材 精密pH計：PHS-3C，上海雷磁；紫外分光光度計：UNLC UV-2000，尤尼柯（上海）儀器有限公司；全自動高壓滅菌器：LMQ.C-80K，新華牌；超凈工作臺：SW-CJ-2F，江蘇通凈凈化設備有限公司；真空冷凍干燥機：FDU1100，山東愛博科技有限公司；低溫臺式高速離心機：Thermo Fisher；電熱恒溫培養箱：DHP-9082，bluepard；500 L發酵罐：KRH-BPJ50/500，江蘇科海生物工程設備有限公司。

1.4 乳酸菌中試（500 L）發酵工藝優化

1.4.1 發酵時間的選擇 接種量：2%；培養溫度：37℃；罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣；檢測指標：接種至500 L發酵罐，30℃培養，每隔2 h取樣一次，檢測發酵液活菌數、OD600值、pH，并繪制生長曲線。

1.4.2 培養溫度的選擇 罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣，分別選擇 30、37、42℃培養 20 h，檢測發酵液活菌數及pH。

1.4.3 攪拌最佳條件優化 罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣，2%接種量，采用不攪拌、轉速100、200、300 r/min條件下培養適宜時間，取樣測定發酵液活菌數。

1.4.4 發酵液pH調控對活菌數的影響 罐壓保持在0.05 Mpa，不通氣，2%接種量，使用一定濃度的NaOH溶液，調整發酵液pH維持在5.0、6.0、7.0，培養20 h，測定發酵液活菌數。

1.5 乳酸菌發酵液離心條件的篩選 離心條件的選擇：分別選擇不同的轉速和時間對等體積同批次發酵液進行離心，然后通過測離心前后活菌數存活率來確定收集高濃度菌體所需要的離心條件。離心條件如表1所示。

表1 乳酸菌發酵液離心條件篩選

懸浮液制備：準確稱取2 L發酵液體經不同離心條件離心收集菌體，用0.9%滅菌生理鹽水重懸至 20 mL，進行活菌數測定。

活菌數的測定：吸取1 mL待測菌液用滅菌的生理鹽水進行10倍梯度稀釋，選擇適當的稀釋梯度，吸取1 mL菌懸液置于平板內，加入15 mL左右的MRS培養基混勻，每個稀釋梯度3個平行。平板在37℃恒溫培養箱培養48 h后，選擇菌落數為30～300的平板進行計數。

存活率/%=M1×V1/M2×V2×100；

式中：M1、M2分別為菌懸液及發酵液活菌；V1、V2分別為菌懸液及發酵液體積。

1.6 乳酸菌凍干保護劑的篩選

1.6.1 凍干保護劑的篩選 選定脫脂奶粉、海藻糖及甘油進行正交試驗設計（表2）。

表2 正交試驗因素水平設計%

1.6.2 冷凍干燥存活率的測定 取相同體積的菌懸液按比例添加不同組合的保護劑，相同條件下進行冷凍干燥，冷凍干燥后制粒，準確稱取1 g菌粉置于99 mL滅菌生理鹽水中，振蕩均勻，制備菌懸液，其余同上。凍干存活率計算公式為（Lijin Huang 等，2006）：

存活率/%=樣品凍干后的活菌數/凍干前的活菌數×100。

1.7 植物乳桿菌菌粉貯存穩定性研究 最佳發酵及后處理工藝條件下制備的菌粉以糊精作為載體稀釋至2×1011cfu/g，分別置于4、-20℃條件下進行貯存，每7 d進行取樣測活菌數，試驗周期維持28 d；活菌數測定方法如上所示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌中試（500 L）發酵工藝優化

2.1.1 發酵時間的選擇 如表3所示，發酵至20 h時發酵液活菌數最高為57×108cfu/mL，此時發酵液pH為3.44，培養至32 h時活菌數下降一個數量級，選擇培養20 h做為發酵終點。

表3 菌株BLPS-9生長曲線

2.1.2 培養溫度的選擇 如表4所示，37℃培養20 h，發酵液pH最低為3.59，發酵液活菌數最高為55×108cfu/mL，后續發酵選擇37℃進行培養。

表4 不同培養溫度對發酵液活菌數的影響

2.1.3 攪拌最佳條件優化 如表5所示，轉速為100 r/min時，發酵液活菌數最高，為58×108cfu/mL，不攪拌條件下發酵液活菌數較低，僅為30×108cfu/mL，可能是因為培養基成分沉于罐底，不利于菌株的發酵生長，后續發酵選擇以100 r/min攪拌培養。

表5 不同攪拌速度對發酵液活菌數的影響

2.1.4 發酵液pH調控對活菌數的影響 如表6所示，調整發酵液維持在6.0活菌數最高，為64×108cfu/mL，較自然pH下活菌數高52.38%，發酵液pH維持在5.0時活菌數為46×108cfu/mL，較自然pH活菌數高9.5%，確定發酵液pH持續維持在6.0活菌數最高。乳酸菌的重要特性就是能夠分解糖類物質產生乳酸。隨著細菌的增殖，培養基的pH會不斷降低，在培養乳酸菌的時候培養基的pH會降低到5以下（陳紅梅，2008）。因而在發酵液中加入一定的緩沖物質，能更好的緩解pH的降低，且其活菌量也較高。這與其他的報道（呂兵等，2001）通過緩解pH方式來實現高密度培養的結果一致。

表6 發酵液pH調控對活菌數的影響

2.2 離心條件的篩選 如表7所示，以10000 r/min離心10 min菌懸液活菌數及存活率最高，分別為5.44×1011cfu/mL、92.25%。 離心轉速越低、時間越短效果越不理想，菌體會隨上清液流失；由于離心力的作用，轉速越高時間越長會造成菌體的機械損傷而死亡。如果離心條件不適，必然導致發酵劑中活菌含量的下降。本試驗所得結果與田洪濤（1998）所報道的“低速長時”或“高速短時”離心收獲的活菌數最多基本一致。

2.3 凍干保護劑的篩選 采用3因素3水平的正交試驗 L9（33）確定脫脂奶粉、海藻糖和甘油的復合配方，試驗結果見表 8和表9。

表7 不同轉速及離心時間對菌懸液活菌數的影響

表8 植物乳桿菌凍干保護劑的篩選

表9 植物乳桿菌最佳凍干保護劑組合的篩選%

不同凍干保護劑對植物乳桿菌BLPS-9凍干存活率影響順序為A＞B＞C，即脫脂奶粉對凍干存活率影響最大，甘油最小。經優化后植物乳桿菌BLPS-9的最佳凍干保護劑配方為A3B2C3。即脫脂奶粉25%、海藻糖7.5%、甘油0.75%。經查表格設計中并無此項，選定凍干存活率較高的組別A3B2C1及A3B3C2做參照，針對最佳凍干保護劑組合進行試驗驗證，結果如下：

如表9所示，最佳凍干保護劑組合A3B2C3即脫脂奶粉25%、海藻糖7.5%、甘油0.75%條件下植物乳桿菌BLPS-9活菌存活率為91.01%，高于A3B2C1的88.14%，除卻計數誤差，活菌數可達6.0×1011cfu/g。

2.4 植物乳桿菌菌粉貯存穩定性研究 如表10所示，植物乳桿菌BLPS-9菌粉在不同條件下貯存，除卻計數誤差，在4℃和-20℃條件下貯存28 d菌粉活菌數無明顯變化，存活率仍能超過90%。

表10 不同貯存條件下植物乳桿菌菌粉活菌數變化 ×108cfu/g

3 結論

3.1 中試發酵工藝條件優化 采用實驗室條件下乳酸菌最優發酵培養基進行（BLPS-9）500 L發酵罐中試試驗，篩選的最佳發酵條件為：培養溫度37℃、轉速100 r/min、不通氣、罐壓維持0.05 Mpa、調控發酵液pH 5.5左右培養20 h，發酵液活菌數維持在50×108cfu/mL以上。

3.2 發酵液最佳離心條件的篩選 通過研究離心轉速和離心時間對植物乳桿菌BLPS-9發酵液活菌數的影響，確定最佳離心條件為10000 r/min、10 min，濃縮100倍菌懸液活菌數可達5.44×1011cfu/mL。

3.3 凍干保護劑篩選 通過正交試驗篩選確定最佳凍干保護劑配方：脫脂奶粉25%、海藻糖7.5%、甘油0.75%，采用此凍干保護劑植物乳桿菌BLPS-9凍干存活率可達91.01%，凍干粉活菌數可達 6×1011cfu/g。

3.4 菌粉貯存穩定性研究 以糊精為載體稀釋植物乳桿菌BLPS-9菌粉至2×1010cfu/g，在不同條件下貯存，除卻計數誤差，在4℃和-20℃條件下貯存28 d菌粉活菌數無明顯損失，可一定程度上提高乳酸菌產品的貨架期。