一株固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣產(chǎn)類胡蘿卜素脈孢菌的分離鑒定

駱 琴， 鄧清月， 唐 森， 張 鵬

（廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西來賓 546119）

脈孢菌屬（Neurospora）真菌是一類腐生菌，有較強的抗逆性，廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境中，該屬真菌易培養(yǎng)且菌體無毒（Gmoser等，2018）。脈孢菌繁殖能力較強，對營養(yǎng)要求簡單，可單獨或聯(lián)合其他菌種發(fā)酵多種農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)類胡蘿卜素及復(fù)合酶制劑，通過發(fā)酵也可將農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為高營養(yǎng)的功能性飼料。

王倩男等（2017）利用好食脈孢菌（N.sitophila）發(fā)酵醋糟生產(chǎn)類胡蘿卜素，色素含量117.68 μg/g，使廢棄的醋糟成為功能性飼料。經(jīng)脈孢菌高溫發(fā)酵后，豆粕中胰蛋白酶抑制因子減少，粗蛋白質(zhì)及酸溶蛋白含量升高，提高了其飼用價值（鄭婷婷等，2015）。王曉杰等（2008）用好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵玉米酒糟，其蛋白質(zhì)組分升高，同時溶解性提高，使其成為一種新型飼料。孫鐵男等（2019）用好食脈孢菌固態(tài)發(fā)酵麥麩生產(chǎn)類胡羅卜素，經(jīng)工藝優(yōu)化后產(chǎn)量為147.38 μg/g，有效提高了麩皮的利用率。 吳邦國（2018）用粗糙脈孢菌（N.crassa）固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理過的玉米秸稈，能有效提高其營養(yǎng)價值，改善其適口性，克服玉米秸稈難消化、營養(yǎng)價值低的問題。賈金如（2017）用粗糙脈孢菌聯(lián)合（Candida utilis和 Phanerochaete chrysosporium）固態(tài)發(fā)酵稻草，降解了其木質(zhì)纖維素，同時提高了蛋白質(zhì)的含量，改善了蛋白類飼料的品質(zhì)。

本試驗從發(fā)霉變質(zhì)的甘蔗渣中分離純化出一株色素產(chǎn)生菌，編號為NC2636。通過觀察其培養(yǎng)特征和顯微特征，以及采用構(gòu)建基于ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹的方法確定菌株NC2636的分類地位。并以菌株NC2636的分生孢子懸液為菌種固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣，采用分光光度法對從發(fā)酵物中提取的色素進行定性定量分析。本研究旨在為菌株NC2636在甘蔗渣功能性飼料化上的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甘蔗渣：由廣西來賓湘桂糖業(yè)有限責(zé)任公司提供；馬鈴薯：市售；無水葡萄糖、技術(shù)瓊脂粉、丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇、異丙醇、β-巰基乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備 中草藥粉碎機 （FW-135），天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-3-S），上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162），太倉市科教器材廠；恒溫搖床（TH2-C），太倉市實驗設(shè)備廠；電子分析天平（FA-2004B），上海越平科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水槽（DK-8D），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式壓力滅菌鍋（TYAIB 024/10），寧波久興醫(yī)療器械有限公司；潔凈工作臺（SW-CJ-1D），江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠；紫外-可見分光光度計（UV-2600），島津企業(yè)管理（中國）有限公司；超聲波清洗機（KQ-300DE），昆山市超聲儀器有限公司；臺式高速離心機（TD5A-WS），湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；冷凍離心機（HC-2518R），安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PCR儀（2720 thermal cycler），美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電泳槽（DYCP-31DN），北京六一儀器廠；穩(wěn)壓電泳儀（DYY-5），北京六一儀器廠；凝膠成像儀（FR980），上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，無水葡萄糖20 g，技術(shù)瓊脂粉18 g，水 1 L，pH 自然，121℃高壓滅菌 20 min。

1.4 菌株分離 采用組織分離的方法，在無菌操作條件下，用接種針挑取霉變的甘蔗渣表面黃色顆粒物質(zhì)劃線于PDA平板培養(yǎng)基，在28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，反復(fù)挑取邊緣菌絲劃線于新的PDA平板，獲得一株真菌純培養(yǎng)物，編號為NC2636，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基4℃保存。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 形態(tài)特征鑒定 形態(tài)學(xué)分類鑒定以 《真菌鑒定手冊》為依據(jù)（魏景超，1797）。將純培養(yǎng)菌株NC2636接種于PDA平板，目測觀察菌落的形態(tài)是否符合脈孢菌屬的基本形態(tài)特征。采用水浸片法制片，挑取不同生長階段的菌絲用乳酸石碳酸棉蘭染液染色，于雙目顯微鏡下觀察菌絲顯微特征并照相。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

1.5.2.1 ITS序列測定 使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，產(chǎn)品編號：SK8259]提取菌株NC2636的基因組DNA。基因擴增以NC2636的基因組DNA為模版，ITS序列擴增引物為真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和 2 通用引物：ITS1 （5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增片段序列長度為600 bp左右。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：模板（菌株 NC2636基因組 DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）1 μL，Taq Plus DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 ITS1、ITS4（10 μmol/L）各 0.5 μL，加雙蒸 H2O 至 25 μL。 PCR 循環(huán)條件：預(yù)變性（94 ℃，4 min）、變性（94 ℃，45 s）、退火（55 ℃，45 s）、延伸（72 ℃，1 min），共 30 個循環(huán)；修復(fù)延伸（72 ℃，10 min）；終止反應(yīng)（4 ℃，4 h）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離檢測。DNA目的條帶經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程 （上海）股份有限公司，產(chǎn)品編號：SK8131]純化回收后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5.2.2 序列分析 將菌株NC2636的ITS序列提交至NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號。將所得序列進行BLAST比對，與Genebank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性分析。從Genebank數(shù)據(jù)庫下載同屬以及相近科屬物種的ITS序列，使用MAFFT 7.0軟件進行多序列比對分析，以Apodus deciduus的ITS序列為外類群，使用MEGA 7.0軟件采用NJ（Neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株NC2636的固態(tài)發(fā)酵 用接種環(huán)挑取28℃光照條件下培養(yǎng)18 h的PDA平板培養(yǎng)基上的菌絲轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃光照條件下培養(yǎng)數(shù)日直至PDA斜面表面產(chǎn)生橙色的分生孢子。用無菌生理鹽水沖洗斜面表面的孢子，倒入裝有玻璃珠的廣口錐形瓶中，搖床振蕩3 h，計數(shù)后配制成濃度為1.5×107個/mL孢子懸液作為接種液。將甘蔗渣置于45℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，粉碎，過20目標(biāo)準(zhǔn)篩備用。取5 g處理好的甘蔗渣置于250 mL廣口錐形瓶中，按液料比4：1加入45℃無菌水20 mL，封口，浸泡4 h后121℃高壓濕熱滅菌30 min。在無菌操作條件下，向冷卻的甘蔗渣培養(yǎng)基內(nèi)接入1 mL孢子懸液，混勻，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，28℃光照條件下靜置培養(yǎng)6 d。

1.7 類胡蘿卜素的提取與測定 參照孫軼男等（2019）方法，略作改動。取烘干后的發(fā)酵產(chǎn)物1.0 g置于研缽中加入1.0 g石英砂，充分研磨后，加入 10 mL 丙酮-乙酸乙酯混合溶液（2：3，V：V），置于超聲波清洗機中超聲處理15 min（300 W，25℃）后，室溫下避光浸提2 h后取出，離心機5500 r/min，離心10 min，收集上清液，即得類胡蘿卜素浸提液。用紫外-可見分光光度計在波長400～700 nm內(nèi)掃描類胡蘿卜素浸提液，確定最大吸收波長，適當(dāng)稀釋提取液后測定最大吸收波長處的吸光度，按以下公式計算類胡蘿卜素含量（鄧永平等，2018；李靜等，2017）：

式中：Aλmax為色素最大吸收波長處的吸光度；N為測定試樣的稀釋倍數(shù)；V為提取色素有機溶劑體積，mL；M為發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量，g；0.16為類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選菌株的鑒定

2.1.1 培養(yǎng)和形態(tài)特征 菌株在PDA平板上，迅速生長，匍匐菌絲白色，疏松，有樹狀分支，沒有典型菌落形成；培養(yǎng)24 h之后肉眼可見菌絲體組織呈絮狀，可見氣生菌絲，均勻生長，呈白色絨毛狀；培養(yǎng)48 h之后，菌絲體粗壯而致密，淡黃色，與培養(yǎng)基結(jié)合較牢固，菌絲體組織表面干燥，上層出現(xiàn)成堆黃色粉末狀顆粒，有一股霉味。

菌株NC2636菌絲經(jīng)乳酸石碳酸棉蘭染色后，菌絲組織成藍色。菌絲組織稀疏，呈絲狀，有分枝，為有隔菌絲；氣生菌絲頂端可觀察到分生孢子鏈；分生孢子為球形、卵圓形至橢圓形。

綜上所述，根據(jù)菌株NC2636的培養(yǎng)特征和顯微特征，查《真菌鑒定手冊》可知，該株真菌與脈孢菌屬（Neurospora）真菌的形態(tài)特征描述較為符合 （魏景超，1797），故通過形態(tài)特征鑒定菌株NC2636應(yīng)為一株脈孢菌（Neurospora sp.）。

2.1.2 菌株NC2636的ITS序列分析 為了進一步明確菌株NC2636的分類地位，提取菌株NC2636基因組DNA，以真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2通用引物進行ITS序列PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，凝膠成像結(jié)果見圖1。擴增得到基因片段凝膠電泳條帶單一、明亮，與Marker條帶比較發(fā)現(xiàn)，目的基因片段大小為500～600 bp，將目的條帶用試劑盒回收后測序。測序結(jié)果表明，菌株NC2636的ITS序列大小為554 bp，兩者相符。

圖1 菌株NC2636的ITS序列PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

將菌株NC2636的ITS序列測序結(jié)果輸入Genbank進行BLAST比對，與Genebank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性分析。結(jié)果顯示NC2636的ITS序列與脈孢菌屬（Neurospora）的多種真菌具有很高的同源性。選取脈孢菌屬內(nèi)與菌株NC2636同源性較高的8株真菌，以及與脈孢菌屬科屬親緣關(guān)系較近的2株真菌，以Apodus deciduus的ITS序列為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，菌株NC2636與Neurospora crassa（KR399979）在同一分支上，同源性達到了100%，結(jié)合其培養(yǎng)特征和顯微特征，故將菌株NC2636鑒定為一株粗糙脈孢菌（Neurospora crassa），菌株NC2636的ITS序列從Genebank數(shù)據(jù)庫獲得的登錄號為MT821452。

圖2 基于ITS序列采用鄰接法構(gòu)建的菌株NC2636系統(tǒng)發(fā)育樹（括號內(nèi)為序列登錄號）

2.2 菌株NC2636的色素特征及含量測定 在可見光區(qū)400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描檢測提取的色素樣品，由圖3可知，最大吸收峰的波長為469 nm，在其兩側(cè)444 nm和501 nm處有兩個明顯的肩峰，符合類胡蘿卜素的“三手指型”特征性吸收曲線（肖亦農(nóng)等，2013；羅金亮等，2013），依據(jù)現(xiàn)有文獻報道類胡蘿卜素化合物最大吸收波長及雙肩峰吸收波長特征可知，番茄紅素可能為菌株NC2636所產(chǎn)的類胡蘿卜素的主要成分（王海濱，2004）。在最大吸收波長469 nm下，測定吸光度，由類胡蘿卜素含量計算公式可以得出，發(fā)酵物類胡蘿卜素含量為95.63 μg/g。

圖3 色素的可見光區(qū)掃描圖譜

3 討論

采用酵母、細菌、放線菌等微生物發(fā)酵甘蔗渣，可以使蔗渣中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解成能被動物體直接利用的糖類物質(zhì)，同時在發(fā)酵過程中由微生物自身代謝生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、氨基酸、還原糖等營養(yǎng)物質(zhì)，能提高甘蔗渣的適口性及營養(yǎng)價值，使其成為一種優(yōu)質(zhì)飼料 （胡詠梅等，2006）。粗糙脈孢菌（N.crassa）具有完整的木質(zhì)纖維素降解酶系，可作為天然的木質(zhì)纖維素快速降解菌（林良才等，2014），已被用于發(fā)酵稻草、玉米秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品，使它們成為營養(yǎng)價值較高的功能性飼料（吳邦國，2018；賈金如，2017）。本研究從霉變的甘蔗渣中分離得到一株粗糙脈孢菌，通過實驗證明該菌株能在單一營養(yǎng)源甘蔗渣上生長并產(chǎn)生類胡蘿卜素色素，其主要成分可能為番茄紅素，但產(chǎn)量較低，因此以甘蔗渣為主要營養(yǎng)源通過發(fā)酵生產(chǎn)類胡羅素卜素為目的固態(tài)發(fā)酵工藝有待于進一步優(yōu)化（闕發(fā)秀等，2019；李靜等，2017；李陳陳等，2017）。綜上所述，粗糙脈孢菌有潛力作為候選菌種通過微生物發(fā)酵方法來解決甘蔗渣飼料化的難題。

4 結(jié)論

本研究通過觀察分離于霉變甘蔗渣中的產(chǎn)色素菌株NC2636的培養(yǎng)特征和顯微特征，并結(jié)合分子生物學(xué)方法將其鑒定為一株粗糙脈孢菌（N.crassa）。通過分光光度法確定菌株NC2636固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣所產(chǎn)的色素為類胡蘿卜素，最大吸收波長為469 nm，推測色素主要成分可能為番茄紅素，28℃固態(tài)發(fā)酵6 d，色素含量為95.63 μg/g。因此，利用菌株NC2636固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣既可能實現(xiàn)甘蔗渣的功能性飼料化，也能獲得天然的類胡蘿卜素，同時為甘蔗渣的資源化利用提供一種思路。