HIF-1α基因多態性與青海地區不同因素人群的相關性研究

范亞莉，洪軍，郭小英，顧錫娟，殷青寧，王珍，蒲蘭青

青海省婦女兒童醫院急診科，青海 西寧 810007

人類不同個體對新環境的遺傳學適應是一個漫長的過程，高海拔適應正是該過程的最好體現[1]。青海地區位于我國西北部，平均海拔在4 000 m以上，氧氣含量只有平原地區的40%，紫外線強度比內地要高30%[2]。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)的主要功能是平衡體內氧含量，其主要由α和β兩個亞基構成，其中的HIF1-α亞基受缺氧調控并調節HIF-1的活性，是體內重要的氧含量調節因子[3]。研究表明，低氧信號通路是調節紅細胞生成的重要途徑，在低氧或缺血損傷條件可阻礙HIF-1α的羥基化過程，使其穩定性增強，從而發揮低氧、缺血條件下的適應和保護作用[4]。本文就HIF-1α基因的9 個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點基因多態性與青海地區不同海拔、民族、性別和年齡人群的相關性進行研究，為未來利用SNP多態性差異對高原地區相關個體相關疾病預防和治療提供一定的科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據知情同意原則，以青海省西寧和玉樹地區進行健康體檢人群作為研究對象，隨機采集2018—2020 年位于海拔2 300 m 的西寧地區(50 例)和海拔 4 000 m 的玉樹地區(100 例)的不同民族(藏族 72 例，非藏族 78 例)、不同年齡(學齡前組30 例，青少年組 120 例)和不同性別(男、女各 75 例)人群的外周血樣本。以上研究對象均在青海省居住10 年以上，本研究經過青海省婦女兒童醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 SNP位點選取及引物設計 根據Hap Map數據庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中選取HIF-1α基因的 9 個 SNP 位點(rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs1957757、rs10873142、rs41508050、rs11549465、rs11549467和rs1802821)，引物由使用Primer5.0設計。

1.2.2 基因分析 將已提取的DNA 及試劑從-20℃冰箱取出后置于室溫下解凍，振蕩混勻，短暫離心。將Custom Taqman?探針(40×)、LightCycler?480預混液(2×)、無DNase 水按說明配好后分裝至384 孔板中，每孔 4 μL，按順序將1 μL DNA 模板加入相應孔中。貼好貼膜，刮平，板式離心機2 000 r/min 離心1 min。使用Roche LC480Ⅱ型熒光定量PCR 儀，按照：95℃ 10 min，95℃ 10 s退火、60℃延伸45個循環的設置，掃描讀取9個SNP位點的探針信號，選擇Genotyping進行等位基因分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0 統計軟件，采用χ2檢驗比較各因素兩種對象中對應SNP位點的基因型表達差異。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各群體中9 個SNP 位點基因型分布 對HIF-1α基因9 個SNP 基因型進行比較分析后發現，SNP 基 因 型 rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs10873142、rs41508050、rs11549465 和 rs11549467 在民族、區域、年齡和性別四個方面比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。但其中 rs61755705 在 150 例樣本中為純合子，皆為GG基因型；rs41508050在所有樣本中為純合子，皆為CC型；rs1802821在在民族、區域、年齡和性別四個方面比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，且在150 例樣本中都為AA 基因型。而rs1957757 和rs11549465分別在年齡和性別中比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 各群體中9個SNP位點等位基因分布 對青海西寧和玉樹地區藏族和非藏族、學齡前和青少年以及不同性別之間群體中HIF-1α基因9 個SNP 位點使用Genotyping 進行等位基因分型檢驗和分析，見表 2。實驗結果表明，9 個 SNP 的等位基因中，SNP 位點 rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs10873142、rs41508050、rs11549467 和rs1802821 在民族、區域、年齡和性別方面比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，而SNP 位點rs1957757 和 rs11549465 在年齡和性別中比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表1 HIF-1α基因SNP基因型在不同群體中的分布比較(例)

表2 HIF-1α基因SNP等位基因在不同群體中的分布比較(例)

3 討論

HIF-1α廣泛表達于多個物種的各組織細胞中，研究表明，HIF-1α基因缺失的小鼠胚胎會因大腦、心臟和血管系統的發育異常而在懷孕中期死亡，說明其在正常發育過程中具有重要作用[5-6]。HIF-1α在常氧條件下很快會被降解，而低氧條件會促進其與β亞基結合形成HIF-1復合物，從而促進和保護機體對低氧環境的適應能力[7]。HIF-1α在人類染色體上編碼基因的位置為14q21-24，具有14個內含子和15個外顯子[8-9]。研究表明，HIF-1α在不同海拔引起的不同低氧環境中表現出選擇作用，這種作用與多種疾病如大腦神經元損傷等有著密切關系。

本研究根據我國多民族人群HIF-1α的基因多態性特點，結合國內外文獻，最終選取了9 個有代表性的SNP 位點(rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs1957757、rs10873142、rs41508050、rs11549465、rs11549467 和rs1802821)。結果顯示，在西寧和玉樹地區、藏族和漢族、青少年和學齡前以及不同性別四組中，rs61755705、rs41508050 和rs1802821 三個位點在150 例樣本中均為純合子，分別為 GG、CC 和 AA 基因型。SNP 位點rs1957757 和rs11549465 等位基因與基因型在年齡和性別中具有顯著性差異，說明該位點等位基因與年齡和性別因素具有相關性。李晟等[9]的研究結果表明，HIF-1α的rs4899056和rs10873142 SNP位點的變異與一氧化碳中毒后中樞神經脫髓鞘損傷有關，從而影響HIF蛋白的功能，但HIF-1α的rs4899056和rs10873142兩個SNP位點在本研究的四組中并未表現出相關性，而在正常組中無變化的rs1957757，在本研究中卻表現出了性別和年齡組中的差異，提示低氧環境差異可能對HIF1-α基因有選擇作用。

青海常住居民對高原環境的適應有著獨特的生理學特征。本課題組前期的研究表明，在青海玉樹地區，不同性別、不同年齡和不同民族兒童的淋巴細胞亞群分布存在差異[10]。以往針對高海拔地區人群的遺傳學研究主要為EPAS1和EGLN1，該兩種基因的多態性對藏族人群高海拔適應具有促進作用，研究表明，這種適應作用與該基因影響藏族人群的血紅蛋白濃度密不可分[2]。而EGLN1是HIF-1α的上游基因，當其在低氧或其他因素所致的基因表達量改變時，也會影響下游HIF-1α的低氧應答，從而通過缺氧誘導因子(hypoxia induced factor,HIF)促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)信號通路中的相關低氧信號蛋白(hypoxia pathway protein，HPP)，最終促進機體在高海拔環境下的低氧適應[4]。

綜上所述，青海地區HIF-1α基因多態性與年齡和性別有相關性。但本文尚有不足：(1)難以獲得更多的民族和年齡組的樣本，造成樣本量偏小；(2)缺乏HIF-1α上下游相關重要基因的研究，造成研究內容不夠系統；(3)缺少平原地區(0 海拔)研究數據作為對照。建議后期做更大的樣本和更完善的對照指標，進行進一步驗證。