DDB2基因不同轉錄本在胃癌和正常胃組織中的表達差異及其對胃癌細胞增殖的影響

鄭博文，劉經緯，孫麗萍，邢承忠

（中國醫科大學附屬第一醫院 1. 肛腸外科；2.腫瘤病因與篩查研究室；3.遼寧省教育廳消化道腫瘤病因與預防重點實驗室，沈陽 110001）

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率在所有癌癥中分別位居第5位和第3位［1］。炎癥和感染導致的DNA損傷積累會增加胃黏膜細胞的基因組不穩定性，進而誘發胃癌［2］。核苷酸切除修復系統 （nucleotide excision repair，NER） 是一種功能強大的DNA損傷修復系統，在保持胃黏膜細胞基因組的穩定性和完整性方面具有重要作用［3］。DNA 損傷結合蛋白2 （DNA damage-binding protein 2，DDB2） 是一種由DDB2基因編碼的分子量為48×103的蛋白質，在NER修復通路中，它參與構成的DDB復合物能夠識別DNA損傷部位，進而啟動NER過程并完成損傷修復［4］。近期研究［5］表明，DDB2亦可通過NER通路之外的途徑影響結直腸癌等多種癌癥的發生和發展，其在調控腫瘤細胞生物學行為方面具有重要作用。

選擇性剪切是將基因或mRNA前體轉錄產生的RNA外顯子以多種方式剪切重連并產生多種不同長度mRNA的過程，這些不同長度的mRNA亦被稱為剪接變異體［6］。選擇性剪切是基因表達調控的關鍵步驟，通過選擇在特定時間和特定細胞中產生剪接變異體，能夠增加細胞的轉錄多樣性；失調的選擇性剪切經常出現在人類腫瘤中，并通過多種途徑調控癌癥的進程［7］。因此，闡明重要基因的不同剪接變異體在胃癌發生、進展中的功能和調控至關重要。檢索NCBI數據庫的子數據庫Nucleotide可知，DDB2基因有2個已被證實的剪接變異體WT和D1。DDB2基因的野生型轉錄本WT含有10個外顯子，全長1 870 bp，編碼含427個氨基酸的蛋白；而變異型轉錄本D1長度較短，N端和C端與常見轉錄本相同，但缺少4個外顯子 （外顯子4、5、6、7），全長717 bp，編碼含238個氨基酸的蛋白。此外有研究［8］指出，DDB2基因rs830083多態突變型GG基因型顯著提高了胃癌的發病風險，而rs830083正好位于D1轉錄本缺失的第4外顯子附近，提示rs830083多態突變型GG基因型可能參與調控D1轉錄本的表達，進而影響胃癌的發生。目前的研究表明，DDB2基因D1轉錄本在胃癌中可能具有重要作用，且DDB2基因的2種轉錄本在胃癌中的表達水平與功能尚不明確。因此，本研究通過實時定量PCR （quantitative real-time PCR，RTqPCR）、CCK-8、Western blotting等方法，深入探討DDB2基因的2種剪接變異體在胃癌細胞中表達水平的差異及其對胃癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇于中國醫科大學附屬第一醫院肛腸外科接受胃癌手術的患者22例，其中男15例，女7例，平均年齡59.2歲。術后30 min內留取胃癌癌灶和遠端正常胃組織，-80 ℃凍存待用。全部病例均經病理組織學檢查確診。本研究獲得中國醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞株：胃癌細胞株BGC823，來自中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤研究所第三研究室細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 組織RNA提取、反轉錄及RT-qPCR檢測：采用RNAiso Plus （日本TaKaRa公司） 提取22對胃癌組織和遠端正常胃組織的總RNA，然后用RT Master Mix（日本TaKaRa公司） 將其反轉為cDNA，最后將cDNA和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ （日本TaKaRa公司） 適量比例混合，以完成qPCR。根據PCR所得的△Ct值，計算標準化的2-△△Ct。DDB2基因WT轉錄本引物：上 游5’-CCAACCAGTTTTACGCCTCCTC-3’，下 游5’-TGTCTCCTGTGACCACCATTCG-3’；DDB2基 因D1轉錄本引物：上游，5’-CACCTTCATCAAAGGGGCAG-3’，下游5’-GAACACGTCGATCGTCCTCA-3’；GAPDH基因引物：上游5’-TCTTCCAGGAGCGAGATCCCT-3’，下游5’-GCAAATGAGCCCCAGCCTTCT-3’。

1.2.2 質粒的構建和轉染：分別構建DDB2基因WT、D1轉錄本的過表達質粒和空載體 （上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）。用含10%胎牛血清的1640培養基在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中，用6孔板培養胃癌BGC823細胞。待BGC823細胞生長至60%～80%時，按照轉染說明書分別將1 μg質粒與2 μL轉染試劑在200 μL緩沖液中混合，混勻后靜置10 min，將混合液其加入到細胞中，4 h后換液。根據所加質粒不同，將BGC823細胞分為空載體組、WT組和D1組，以進行后續實驗。

1.2.3 Western blotting：收集各組BGC823細胞，在100 μL RIPA （上海索萊寶生物科技有限公司） 中裂解并提取細胞總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司） 測定蛋白濃度并配平。加入5×loading buffer煮沸5 min。之后使用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，每孔加入蛋白30 μg，濃縮膠70 V 30 min，分離膠110 V 90 min。切下待用的凝膠后用三明治法濕轉120 min，將蛋白轉印于PVDF膜上。用10%脫脂牛奶室溫封閉1 h。PBST清洗后孵育一抗 （Flag抗體，日本GNI公司；GAPDH抗體，德國Bioworld公司；PARP抗體，美國Cell Signaling Technology公司；E-Cadherin抗體，美國Abcam公司），4 ℃ 過夜；PBST清洗后室溫孵育二抗 （兔二抗，美國Abcam公司） 2 h，PBST清洗后用發光液 （上海碧云天生物技術有限公司） 發光，顯影后保存圖片，觀察Flag蛋白、PARP蛋白和E-cadherin蛋白的表達水平，以檢測各組細胞的轉染、凋亡和上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 情況。

1.2.4 CCK-8增殖實驗：在各組BGC823細胞狀態穩定后，用胰酶將細胞消化下來并計數。將細胞懸液濃度調整至3×104/mL，在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液。提取剩余細胞的總蛋白，通過Western blotting檢測質粒上的3*Flag來檢測各組的轉染情況。分別在24、48和72 h后，向每孔加入10 μL CCK-8試劑 （美國MCE公司），2 h后檢測其在450 nm處的光密度 （optical density，OD） 值并進行比較。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DDB2基因WT、D1轉錄本在胃癌和遠端正常胃組織中的RNA表達水平

通過RT-qPCR檢測22對胃癌組織及其對應的遠端正常胃組織中DDB2基因WT、D1轉錄本的RNA表達水平。RT-qPCR結果顯示：胃癌中DDB2基因D1轉錄本的RNA表達水平顯著高于遠端正常胃組織 （P＜0.01），而WT轉錄本在胃癌和遠端正常胃組織中的RNA表達水平無統計學差異。見表1。

2.2 DDB2基因WT、D1轉錄本對胃癌細胞增殖能力的影響

表1 胃癌和遠端正常胃組織中WT和D1轉錄本RNA表達水平的差異Tab.1 Content of WT and D1 transcripts in gastric cancer and corresponding normal gastric tissues

Western blotting結果顯示：空載體組、WT組和D1組質粒均成功轉染入BGC823細胞中。CCK-8實驗發現，培養48和72 h后，WT組的OD值大于空載組（P＜ 0.05），而D1組的OD值小于空載組 （P＜ 0.01）。表明DDB2基因WT轉錄本促進胃癌細胞增殖，而D1轉錄本抑制胃癌細胞增殖。見圖1、圖2。

2.3 DDB2基因WT、D1轉錄本對胃癌細胞的凋亡行為和EMT現象的影響

圖1 BGC823細胞質粒轉染情況Fig.1 Plasmid transfection of BGC823 cells

Western blotting結果顯示：各組細胞中E-cadherin蛋白和PARP水解產物的表達量無明顯差異，提示DDB2基因WT、D1轉錄本對胃癌細胞的凋亡行為和EMT現象無明顯影響。見圖3。

3 討論

NCBI在線數據庫顯示，DDB2基因有WT、D1兩種轉錄本。QIAO等［9］發現，在胃癌中DDB2基因WT轉錄本編碼的DDB2野生型蛋白可以抑制PAQR3的泛素化進程，但并未提及其在胃癌和遠端正常胃組織中表達量的差異，其表達量情況與本研究相符。DDB2基因的D1轉錄本與WT轉錄本相比缺少4個外顯子，其編碼蛋白發揮的功能可能有較大差異。RTqPCR結果顯示，D1轉錄本的RNA表達水平在胃癌和遠端正常胃組織中有統計學差異 （P＜ 0.01），這使得D1轉錄本有可能成為胃癌的篩查標志物，其具體應用仍需后續實驗加以探索。

圖2 WT、D1轉錄本對BGC823細胞增殖能力的影響Fig.2 Effects of WT and D1 transcripts on the proliferation of BGC823 cells

圖3 BGC823細胞中E-cadherin與PARP水解產物的表達量Fig.3 Expression of E-cadherin and PARP hydrolysate in BGC823 cells

本研究中，CCK-8結果顯示，與轉染了空載質粒的BGC823細胞相比，轉染WT轉錄本質粒的BGC823細胞增殖效應增強 （P＜ 0.05），與QIAO等［9］的結果相符；而轉染D1質粒的BGC823細胞增殖效應減弱 （P＜0.01）。這種同一基因的不同轉錄本發揮不同功能的現象并非個例。檢索PubMed數據庫可知，其他基因如TERF1等［10］的剪接變異體可以影響癌細胞的生物學功能，甚至其多種轉錄本發揮的作用完全相反。結合RT-qPCR結果大膽推測：DDB2基因D1轉錄本可能在胃癌中發揮抑癌作用，在檢測到細胞癌變傾向后D1轉錄本大量轉錄以抑制胃細胞癌變，并在胃細胞癌變不可逆之后仍然保持高轉錄效率，起到抑制胃癌細胞生長的作用。

凋亡是細胞重要的生物學行為之一，本研究通過Western blotting檢測胃癌細胞中PARP水解產物的蛋白表達量，判斷DDB2基因的2種轉錄本對細胞凋亡的影響。有研究［11］表明，DDB2基因WT轉錄本編碼蛋白可以識別DNA損傷，并通過NER通路修復損傷；若DNA損傷積累過多，則WT轉錄本蛋白可下調P21蛋白并促進細胞凋亡。但是本研究在胃癌細胞中并未發現相似結論。結合本研究結果進行推斷，DDB2基因WT編碼的野生型蛋白主要負責DNA損傷的識別，僅能根據DNA損傷的程度決定是修復損傷還是促使細胞凋亡［12］；其本身的表達量對細胞凋亡的進程可能影響不大。ROY等［13］發現，DDB2可以抑制VEGF、Snail和Zeb1基因的表達，進而抑制結腸癌細胞的EMT現象，但是本研究并未發現DDB2基因WT轉錄本對胃癌細胞的EMT現象產生影響。雖然胃癌與結腸癌均為消化道腫瘤，但是胃癌細胞與結腸癌細胞在形態、功能、蛋白組成方面均有較大差異。正是因為這些差異，DDB2在兩者中發揮的作用可能并不相同，其具體原因仍需后續實驗加以論證。

綜上所述，本研究檢測了DDB2基因的2種轉錄本在胃癌組織和遠端正常胃組織中的RNA表達水平，并發現D1轉錄本在胃癌中高表達，而WT轉錄本在2種組織中的RNA表達水平并無明顯差異。而后在體外實驗中發現，DDB2基因WT轉錄本促進胃癌細胞增殖，而D1轉錄本抑制胃癌細胞增殖。目前DDB2基因的2種轉錄本在胃癌中的作用機制尚不明確，仍需后續實驗加以探索。通過對胃癌中DDB2基因WT、D1轉錄本的深入研究，可以進一步解釋胃癌的發生、發展機制，有利于發現更好的胃癌治療手段。