SIRT1參與硫化氫改善同型半胱氨酸誘導的海馬氧化應激損傷

魏海軍 王玥 胡亞 趙美 伍愛榮 趙忠桂 張慶麗

[摘要] 目的 探討沉默信號調節因子1（SIRT1）是否參與硫化氫（H2S）改善同型半胱氨酸 （Hcy）誘導的海馬氧化應激損傷。 方法 隨機將雄性SD大鼠分成9組，即正常（CON）組、Hcy（0.2 μmol）（H1）組、Hcy（0.6 μmol）（H2）組、Hcy（2.0 μmol）（H3）組、Hcy（0.6 mol）+NaHS（30 μmol/kg）（H2+N1）組、Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）（H2+N2）組、正常+NaHS（100 μmol/kg）（C+N2）及Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+ SIRT1的抑制劑Sirtinol（10 nmol）（H2+N2+S）組、正常+Sirtinol（10 nmol）（C+S）組，每組10只。采用側腦室微量注射Hcy建立Hcy神經毒性模型，并在Hcy注射前2 d以腹腔注射NaHS及側腦室注射Sirtinol 共同預處理 SD大鼠2 d，然后與 Hcy共處理7 d;各種試劑盒檢測大鼠海馬總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。 結果 與CON 組比較，H1、H2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降（P<0.01）及MDA表達水平升高（P<0.001）;與H2組比較，H2+N2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯上升（P<0.01）及MDA表達水平明顯降低（P<0.01）。此外，與H2+N2組比較，H2+N2+S組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯下降（P<0.01）及MDA表達水平明顯上升（P<0.01）。 結論 SIRT1 參與H2S減輕Hcy導致的海馬氧化應激損傷。

[關鍵詞] SIRT1;硫化氫;同型半胱氨酸;海馬氧化應激損傷

[中圖分類號] R745.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）36-0033-04

SIRT1 participation in hydrogen sulfide to improve homocysteine-induced hippocampal oxidative stress damage

WEI Haijun? ?WANG Yue? ?HU Ya? ?ZHAO Mei? ?WU Airong? ?ZHAO Zhonggui? ?ZHANG Qingli

Medical School， Hunan Polytechnic of Environment and Biology， Hengyang? ?421005， China

[Abstract] Objective To explore whether Silent Signal Regulator 1 （SIRT1） participates in hydrogen sulfide （H2S） to improve homocysteine （Hcy）-induced hippocampal oxidative stress damage. Methods Male SD rats were randomly divided into 9 groups， as the normal （CON） group， the Hcy （0.2 μmol） （H1） group， the Hcy （0.6 μmol） （H2） group， the Hcy （2.0 μmol） （H3） group， the Hcy （0.6 mol）+NaHS （30 μmol/kg） （H2+N1） group， the Hcy （0.6 μmol）+NaHS （100 μmol/kg） （H2+N2） group， the normal+NaHS （100 μmol/kg） （C+N2） group， the Hcy （0.6 μmol）+NaHS （100 μmol/kg）+SIRT1 inhibitor Sirtinol （10 nmol） （H2+N2+S） group， and the normal+Sirtinol （10 nmol） （C+S） group， with 10 rats in each group. Microinjection of Hcy into the lateral ventricle was used to establish the neurotoxicity model of Hcy. Two days before Hcy injection， NaHS was injected into the intraperitoneal cavity and Sirtinol was injected into the lateral ventricle to pretreat SD rats for 2 days. Then， the rats were co-treated with Hcy for 7 days.? Various kits were used to detect contents of hippocampal total antioxidant capacity （T-AOC）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in the rats. Results Compared with the CON group， the contents of hippocampal T-AOC and SOD of the H1 and H2 groups were decreased （P<0.01）， and the MDA expression levels were increased （P<0.001）. Compared with the H2 group， the contents of hippocampal T-AOC and SOD of the H2+N2 group were increased significantly （P<0.01）， and the MDA expression level was decreased significantly （P<0.01）. Compared with the H2+N2 group， the contents of hippocampal T-AOC and SOD of the H2+N2+S group was significantly decreased （P<0.01）， and the MDA expression level was significantly increased （P<0.01）. Conclusion SIRT1 participates in H2S to reduce Hcy-induced hippocampal oxidative stress damage.

[Key words] SIRT1; Hydrogen sulfide; Homocysteine; Hippocampal oxidative stress damage

同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）可引起神經細胞的炎癥反應[1]。此外，研究發現Hcy可導致小鼠神經變性[2]。而硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是一種內源性氣體分子，具有神經保護作用[3]。Kang等[4]報道，H2S對Hcy導致的神經細胞衰老具有抑制作用。而在學習和記憶的形成中，沉默信號調節因子1（Silent information regulator，SIRT1）是必需的。Tang等[5]發現，H2S可減輕Hcy引發的大鼠學習記憶損傷，其機制與上調SIRT1表達有關。本研究將從氧化應激的新視角，觀察SIRT1 是否與H2S減輕Hcy導致的海馬氧化應激損傷有關，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1試劑和儀器? NaHS、Hcy及各種檢測試劑盒（Sigma公司）。微量注射泵、側腦室注射用系列套管及大鼠腦立體定位儀（美國 Stoelting 公司）。電子分析天平（日本島津公司）。

1.1.2 實驗動物? 購買雄性 SD 大鼠（長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，260～300 g），將其飼養1周，給予自由飲水及飲食。實驗的操作均符合中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》中的規定，并經本單位醫學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.3 藥品的配制? ①Hcy注射液的制備：用天平量取 0.33 645 g 固態Hcy，將其放入5 mL生理鹽水中，使其充分溶解成為0.5 μmol/μL的母液;②NaHS注射液的制備：用天平量取 100 mg 固態硫氫化鈉，將其放入1 mL雙蒸水中，使其充分溶解成為100 mg/mL的母液。將二者都保存在 -20℃ 冰箱，備用。

1.2 方法

1.2.1 動物分組? 隨機將雄性SD大鼠分成9組，即正常（CON）組、Hcy（0.2 μmol）（H1）組、Hcy（0.6 μmol）（H2）組、Hcy（2.0 μmol）（H3）組、Hcy（0.6 mol）+NaHS（30 μmol/kg）（H2+N1）組、Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）（H2+N2）組、正常+NaHS（100 μmol/kg）（C+N2）及Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+SIRT1的抑制劑Sirtinol（10 nmol）（H2+N2+S）組、正常+Sirtinol（10 nmol）（C+S）組，每組10只。

1.2.2 給藥方法&nbsp; H1、H2、H3組連續7 d側腦室給藥Hcy。確定H2組為損傷濃度后，在大鼠側腦室給藥Hcy前2 d，對其進行腹腔注射NaHS（30 μmol/kg或100 μmol/kg），連續 9 d。確定NaHS保護組濃度為100 μmol/kg后，再用Sirtinol（10 nmol/d，icv）及NaHS （100 μmol/kg/d，ip）共同預處理 SD大鼠2 d，然后與 Hcy （0.6 μmol /d，icv）共處理7 d。

1.2.3試劑盒測定大鼠海馬中T-AOC、SOD和 MDA表達水平? 取9倍體積的 0.9%氯化鈉溶液放入各組大鼠的海馬組織中，以制備海馬組織勻漿，將其離心后取上清，并采取BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，再按相應試劑盒說明書上的步驟進行檢測。

1.3觀察指標及評價標準

觀察指標：各種試劑盒測定大鼠海馬中T-AOC、SOD和 MDA表達水平。

評價標準：各組比較T-AOC、SOD和 MDA的含量高低，T-AOC、SOD含量降低和MDA含量越高代表氧化應激損傷程度越嚴重。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）顯示。組間比較及隨機成組設計分別用LSD-t檢驗和單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hcy可減少大鼠海馬組織中T-AOC、SOD的含量及增加MDA水平

與CON 組比較，H1、H2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降（P<0.01）及MDA表達水平升高（P<0.001），提示 Hcy可引發大鼠海馬氧化應激損傷。見表1。

2.2 H2S 可拮抗Hcy降低大鼠海馬組織中T-AOC、SOD的含量及升高MDA含量的作用

與H2組比較，H2+N2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯上升（P<0.01）及MDA表達水平明顯降低（P<0.01），說明H2S可減輕Hcy引發的大鼠海馬氧化應激損傷。見表2。

2.3 Sirtinol 可逆轉 H2S 對 Hcy 誘導大鼠海馬組織中T-AOC、SOD的含量下降及 MDA 水平增加的抑制作用

與H2+N2組比較，H2+N2+S組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯下降（P<0.01）及MDA表達水平明顯上升（P<0.01），說明Sirtinol 取消了H2S 可減輕Hcy 引發海馬氧化應激損傷的作用，提示SIRT1 參與H2S減輕Hcy引發的海馬氧化應激損傷。見表3。

3 討論

研究證實 Hcy 可損傷PC12細胞[6]及引起動物大腦的線粒體功能障礙[7]。Kumar[8]等報道H2S 可通過增加內源性硫化氫水平來減輕Hcy引起的神經化學變化。此外，研究發現H2S可改善 Hcy 的神經細胞毒性[9]及減弱 Hcy 誘導的SD 大鼠學習記憶能力損害[10]。但是H2S的這種作用，需進一步闡明其機制，氧化應激是引起神經系統方面疾病的一個重要因素。T-AOC含量越高代表組織總抗氧化能力越好，此外，SOD是機體內重要的抗氧化酶，其活性越高代表組織的抗氧化應激能力越強，而MDA是一種氧化應激中脂質過氧化的重要中間產物，可反映海馬組織氧化損傷的程度[11]。本研究發現，與CON 組比較，H1、H2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降及MDA含量增加，而與H2組相比，H2+N2組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量明顯上升而MDA含量明顯下降，表明硫化氫可減輕Hcy導致的氧化應激。SIRT1在神經保護方面起著重要作用，研究發現棕櫚酸依賴的NAD+耗竭會引起SIRT1的功能障礙，并進一步可能刺激Aβ的產生[12]。Tang等[13]發現五味子酚可改善東莨菪堿所致的AD小鼠認知功能障礙，其機制是與激活SIRT1-PCG1α信號及抑制tau蛋白的磷酸化有關。SIRT1還可調節海馬氧化應激損傷[14]，本研究發現與H2+N2組比較，H2+N2+S組大鼠海馬T-AOC、SOD的含量下降及MDA表達水平明顯上升。這說明Sirtinol 取消了H2S 可減輕Hcy引發海馬氧化應激損傷的作用，也提示SIRT1 參與H2S減輕Hcy引發的海馬氧化應激損傷。此外，顧依靜等[15]研究發現，在大鼠H9c2心肌細胞中，用過氧化氫誘導氧化應激模型時，H2S可提高SIRT1的活性及減少MDA的含量。賈強等[11]發現H2S可通過抑制海馬組織氧化應激損傷來減輕糖尿病大鼠的學習記憶障礙。此外，Tabassum等[16]報道H2S可通過影響線粒體氧化應激發揮抗氧化功能，Kang等[4]提出H2S可減輕Hcy導致的神經細胞衰老，其機制與SIRT1表達有關。這提示了SIRT1在H2S抗氧化應激損傷中的作用不可忽視，值得進一步深入研究，以明確SIRT1的具體作用機理。

此外，腦源性神經營養因子（Brain-derived neu-rotrophic factor，BDNF）是一種神經保護因子，研究表明H2S可減輕甲醛（Formaldehyde，FA）誘導的大鼠認知功能障礙，其機制是與調節BDNF表達有關[17]，同時，Liu等[18]發現BDNF-TrkB通路介導了H2S在糖尿病大鼠中的抗抑郁作用，其機制是通過促進海馬自噬，此外，Fahimeh等[19]報道在出生后早期的雄性幼鼠中給予酒精，會引起幼鼠的空間記憶障礙，但是H2S可通過增加BDNF水平來減輕幼鼠的空間記憶障礙。以上提示BDNF也可能在H2S改善Hcy誘導的海馬氧化應激損傷中發揮作用。

綜上所述，SIRT1參與了H2S改善Hcy導致的海馬氧化應激損傷還需更加深入地探討，本研究為H2S拮抗Hcy神經毒性機制的研究提供了新思路，也為探討出更多防治與Hcy相關的神經退行性疾病提供了新靶點。

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（收稿日期：2021-03-02）