大豆猝死綜合癥病原菌的土壤分離與分子檢測技術應用分析

摘要：大豆猝死綜合癥是世界大豆主產國發生的新真菌病害，近幾年趨于嚴重，SDS是土傳病害，可隨大豆貿易傳入新的地區。中國是美國大豆進口大國，為保護我國大豆生產，研究確立SDS檢測技術，對口岸采集圖土樣檢測。對分子檢測技術進行改進，采用PCNB選擇性培養基對口岸采集圖樣稀釋培養，在ITS2設立特異引物FVS/A，產生650bp左右的電泳條帶，對土樣進行分子檢測，表明可鑒別SDS病原菌北美種。

關鍵詞：大豆猝死綜合癥；檢測技術；土壤分離

大豆猝死綜合癥是大豆發生的鐮刀菌引起的土傳病害，是我國關注列入新修訂進境植物檢疫危險性病蟲雜草名錄有害生物。1971年在阿肯色州首次發現，目前廣泛分布于巴西等大豆產區，造成巨大經濟損失。菜豆根腐病菌在PDA培養基礎上，菌落特征與SDS病原菌相似，2003年Aoki等根據為害地區分子系統發育特征，將SDS病原菌分為南北美種，國外關于SDS病原菌的研究較多，但未涉及與F.phaseoli區分。研究采用分析RFLP圖譜可區分SDS病原菌。本實驗找到特異引物，將SDS病原菌與其他Fusarium spp區分，優化PCR檢測技術，建立適合口岸應用的分子檢測技術。

1. 大豆猝死綜合癥病原菌相關研究

大豆為豆科大豆屬，中國種植大豆已有五千多年的歷史，其品種豐富，世界上其他國家栽培大豆大多從中國傳播。大豆是我國重要油料作物，是主要的牲畜飼料。世界上為害大豆的病蟲害有上百種，列入我國檢疫性有害生物為害病害有菜豆細菌性萎蔫病菌、煙草環斑病毒等。近年來，一些新興有害生物引起各國學者的廣泛關注。大豆猝死綜合癥由2種鐮刀菌引致，造成損失達100%，病菌可在土壤存活多年。

1982年大豆猝死綜合癥病原菌定名為Fusarium solani，2003年SDS病菌分為南北美種。大豆猝死綜合癥危害性大，美國約有13個州發生過SDS，常見損失為5%-15%，我國是大豆生產大國，產量位列世界第四。大豆猝死綜合征主要分布于巴西等國，自1971年SDS首次發現后迅速擴展到密蘇里、田納西、依阿華等州。1991年阿根廷在彭巴斯草原首次報道SDS發生，阿根廷的SDS病原菌有南北美種。1992年巴西首次報道SDS，現SDS遍布巴西200多萬公頃大豆產區。

SDS在1971年出現時未確定病名，1982年M.C.Hirrel將其命名為大豆猝死綜合征，由于病害進展與品種抗性等有關，敏感品種的未成熟植物會快速死亡，發病葉部組織很快枯死。SDS可表現在幼苗期，環境條件適合植株停止發育。SDS幼苗期癥狀表現為植株矮小，斑點沿葉脈擴大。SDS葉部癥狀為葉面出現圓形褪綠色斑點，最終全部枯黃組織壞死。葉片邊緣伴隨卷曲現象。發病時葉片脫落，可導致花果發育不全，高溫天氣癥狀減輕。葉面不表現癥狀，根部無癥狀，嚴重感病植株主根形成藍色菌落，可作為田間鑒定SDS特征。

大豆猝死綜合癥危害性大，容易導致植株豆粒小，嚴重影響大豆產量。近幾年在美國發生趨于普遍，低溫多雨年份損失達100%。數據表明，SDS成為制約大豆產量的重要因素。我國每年要從國外進口大量大豆，主要出口國為大豆猝死綜合征疫區。大量進口國外大豆會增加危害性有害生物入侵中國的風險。國家質檢局設立大豆猝死綜合征病菌檢疫技術研究課題，已列入我國公布禁止進境的危險性病蟲雜草名單。

2. SDS土壤分離與分子檢測實驗

供試菌株來自阿肯色大學植物病理系大豆實驗室，大豆疫霉菌由實驗室分離保存。檢測土樣來自沿海口岸大豆船只，主要來自巴西等大豆猝死綜合癥多發國家。實驗儀器包括核算蛋白檢測儀、臺式冷凍離心機、PTC-200型PCR擴增儀。試劑購自華美生物工程公司，MgCl、Taq DNA聚合酶購自Promega公司，引物由上海英俊生物公司合成。

PCNB選擇性培養基，參照報告SDS病菌選擇性培養基MNSM配方，以其中1/5氯硝基苯英文縮寫命名為PCNB，配方為15g蛋白胨，0.5g硫酸鎂。高壓滅菌冷卻50℃，加入0.34g新霉素，0.1g氯四環素。從5株Etucumamiea菌種保存土壤中挑取少量土壤，加入1ml無菌水中，取200μl涂于PCNB平板，23℃光照培養。從斜面培養基挑取少量菌絲，每份土樣取2g放入100ml0.2%水瓊脂中，稀釋10倍，取土壤稀釋液1ml涂抹于PCNB平板，23℃光照培養，參照SDS病原菌特征，挑取菌落轉移至PDA營養培養基培養。

挑取目標菌落孢子，用無菌水稀釋到孢子清晰個數，挑取單個孢子轉移到PDA平板培養，用滅菌刀片掛去菌絲。真菌ITS區通用引物ITS1/4，在TIS2區SDS病原菌南北美種與菜豆種有少量穩定突變位點，用OMIGA對比，設計特異引物FVS/A。PCR反映體系：25mmol/1MgCl2 2μl，10μmol/l引物各1μl，模板DNA4ng。反應條件經35個循環，72℃延伸10min，EB染色15min。大豆猝死綜合征病原菌在選擇性培養基PCNB上生長緩慢，中心有黃色突起，缺乏氣生菌絲。PDA上菌落缺乏氣生菌絲。在PDA上菌落與SDS病原菌絡相似。對照標準菌株未發現與病原菌相似菌落，挑選菌落培養進行分子檢測。

3. 結束語

本實驗對大豆猝死綜合癥病原菌分子檢測的改進，進行普通PCR可達到檢測目的。相比其他研究，技術成本低，結果易于分析。Southern雜交是很好的研究植物病原種群結構工具，是復雜的DNA檢測技術。等位基因特異性PCR對引物要求高，為避免反映中出現假陰性結果，加入陽性質控引物。大豆猝死綜合征病原菌北美種廣泛分布于阿根廷，傳入中國可能性大，實驗建立北美種檢測鑒定方法。未來應研究SDS致病機制，建立南美種鑒定方法，用于實際檢疫工作。

作者簡介：

徐鑫（1983.4-），男，漢族，山東濟寧人，研究生，中級農藝師，研究方向：農業環保。