自噬與氧化應(yīng)激在缺血性腦卒中中的研究進(jìn)展

陳 健，張 哲 綜述 鐘士江 審校

卒中是世界上同時(shí)擁有高致死率及高致殘率的一種疾病，隨著全球人口的增加，與卒中相關(guān)的“卒中人群”在過(guò)去數(shù)十年內(nèi)呈現(xiàn)不可思議的上升趨勢(shì)[1]。在很多地區(qū)，卒中已經(jīng)成為了嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)匦l(wèi)生健康的頭號(hào)疾病[2]。在中國(guó)，因?yàn)槔淆g化等多種因素，卒中疾病的發(fā)生發(fā)展速度更是超過(guò)了之前任何時(shí)期。眾多卒中患者因?yàn)榘c瘓喪失自理能力，這無(wú)疑為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)增加了巨大負(fù)擔(dān)[3]。除此之外，對(duì)患者來(lái)說(shuō)一個(gè)更嚴(yán)肅的問(wèn)題是面對(duì)卒中所致的偏癱，現(xiàn)有的臨床技術(shù)更多時(shí)候只能延緩癱瘓的進(jìn)程，而不能治愈癱瘓，其中一個(gè)重要因素就是治療過(guò)程中缺血性腦卒中容易向腦出血轉(zhuǎn)換[4]。雖然目前人們對(duì)腦卒中的研究已經(jīng)足夠多，但是超溶栓時(shí)間窗的卒中患者基本無(wú)法完全恢復(fù)身體健康[5]。因此，探討新的治療方案仍然是神內(nèi)科醫(yī)師追求的目標(biāo)，筆者將較新穎的自噬機(jī)制與經(jīng)典的氧化損傷途徑在缺血性腦卒中中的最新進(jìn)展做綜述。

1 自噬對(duì)缺血性腦卒中的作用

1.1 自噬的主要特點(diǎn) 自噬是指細(xì)胞降解或循環(huán)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器作為成分去維持代謝及細(xì)胞存活的一種細(xì)胞“自己吃自己”的過(guò)程。自噬在細(xì)胞內(nèi)扮演著“管家”角色，自噬的過(guò)程有助于細(xì)胞清除衰老的細(xì)胞器、異常存活的錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)[6]。除此之外，自噬還參與了細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育分化的方方面面，自噬通過(guò)不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控參與到正常的細(xì)胞生化功能，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞防御損傷，例如缺氧、活性氧、DNA損傷、蛋白質(zhì)聚集、細(xì)胞內(nèi)病原體清除等多項(xiàng)功能[7]。自噬缺陷往往會(huì)導(dǎo)致很多疾病，例如，神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病及癌癥，因此掌握自噬的機(jī)制對(duì)治療這些疾病具有重要的意義。令人欣慰的是在這些疾病中，人們發(fā)現(xiàn)自噬的上調(diào)或許是一條比較好的治療神經(jīng)退行性疾病的治療方案，研究者已經(jīng)通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明了自噬的上調(diào)可以清除位于神經(jīng)細(xì)胞中的異常折疊蛋白質(zhì)，延長(zhǎng)細(xì)胞或動(dòng)物模型的生存期[8]。另一方面，自噬在癌癥與神經(jīng)退行性疾病中又扮演著不同的角色，研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以保護(hù)癌細(xì)胞免受免疫細(xì)胞攻擊，抑制自噬或許對(duì)治療癌癥有幫助[9]。

自噬的雙重角色作用意味著對(duì)于自噬的理解，我們目前的研究還很有限。目前來(lái)說(shuō)自噬被至少30種自噬相關(guān)蛋白(ATG)調(diào)控，在復(fù)雜的ATG的調(diào)控下，這些被清除的細(xì)胞器或異常蛋白被隔離在一個(gè)雙層膜的囊內(nèi)，這個(gè)囊稱(chēng)之為自噬小體(autophagosomes)，最后通過(guò)自噬小體與溶酶體的定向結(jié)合，形成自噬溶酶體(autolysosomes)，衰老的細(xì)胞器或異常蛋白被降解，自噬過(guò)程完成[10]。被降解的內(nèi)容物會(huì)重新參與到細(xì)胞能量代謝物質(zhì)的合成，如氨基酸、核酸、糖或脂肪酸等[11]。自噬發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有兩種常用的作為檢測(cè)自噬過(guò)程的蛋白，一種是LC3(Light chain 3)常作為自噬標(biāo)志物，LC3-Ⅱ蛋白的增多常被認(rèn)為是自噬小體的生成增加，或者自噬小體與溶酶體結(jié)合被阻止從而減少了LC3-Ⅱ的降解，因此單純的Western blot實(shí)驗(yàn)證明LC3-Ⅱ升高并不能說(shuō)明自噬過(guò)程的活化。另一個(gè)P62蛋白被認(rèn)為是自噬底物，隨著自噬進(jìn)展P62蛋白逐漸被降解，判斷自噬的進(jìn)程常常需要借助這兩種蛋白來(lái)綜合分析。

1.2 缺血性腦卒中自噬異常 自噬在細(xì)胞中經(jīng)常扮演著雙刃劍的角色，適當(dāng)?shù)淖允杀徽J(rèn)為對(duì)缺血神經(jīng)細(xì)胞是有保護(hù)作用的，過(guò)度的自噬又被認(rèn)為是可以促進(jìn)細(xì)胞死亡的[12]。急性的腦缺血能夠?qū)е卵鹾推咸烟枪?yīng)的減少，從而引起一系列的代謝變化，這一過(guò)程包括細(xì)胞能量供應(yīng)不足導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡[13]。自噬也參與到了這種神經(jīng)元缺血、缺氧誘導(dǎo)的死亡過(guò)程中。但是自噬的具體作用仍然未知，研究者已經(jīng)得出了不同的結(jié)果：一部分人認(rèn)為，早期缺血情況下誘導(dǎo)自噬可以保護(hù)神經(jīng)元，減少缺血再灌注損傷[14]；另一部分人認(rèn)為，抑制自噬才能有效保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧缺血誘導(dǎo)的損傷。這兩類(lèi)說(shuō)法都不算少見(jiàn)，這種矛盾說(shuō)法可能跟所用動(dòng)物或者細(xì)胞模型及藥物的選擇有關(guān)。另外，受早期人們把自噬與自噬流阻滯混淆有關(guān)。但值得明確的是一些早就被證明有效的神經(jīng)保護(hù)劑，如西羅莫司和白藜蘆醇等也被證明能夠通過(guò)調(diào)控自噬修復(fù)缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。炎性反應(yīng)也是缺血缺氧常見(jiàn)的一種損傷，自噬與炎性反應(yīng)之間具有復(fù)雜的關(guān)系，缺血缺氧后的自噬可以減少細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)的發(fā)生。Nakahira等[15]發(fā)現(xiàn)LC3等自噬標(biāo)記蛋白確實(shí)增強(qiáng)了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠炎性因子的分泌。同樣這些炎性因子如干擾素、IL-1/2等也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的進(jìn)展。故炎性反應(yīng)與自噬之間必然存在某種復(fù)雜的聯(lián)系，在腦缺血缺氧損傷中，這二者又是同樣常見(jiàn)的病理過(guò)程，故研究二者的關(guān)系必將有助于進(jìn)一步理解腦卒中的發(fā)病機(jī)制。

不同藥物對(duì)自噬的調(diào)控作用可能存在著正好相反的結(jié)果，如Wang等[16]證明葛根素就是通過(guò)激活A(yù)MPK-mTOR-ulK 1通路來(lái)減輕自噬從而保護(hù)缺血的大鼠模型，而其他的研究者認(rèn)為黃連解毒素是通過(guò)MAPK通路促進(jìn)保護(hù)性自噬的發(fā)生達(dá)到保護(hù)腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞的存活[13]。故自噬在腦缺血中扮演的仍然是雙重作用的角色，這或許與不同的動(dòng)物模型以及藥物誘導(dǎo)有關(guān)，在自噬與腦缺血損傷的研究中，不同的藥物引起的自噬可能是增強(qiáng)，也可能是阻滯，但是都可能會(huì)引起保護(hù)效應(yīng)，這其中的具體機(jī)制有待研究。

2 缺血性腦卒中氧化應(yīng)激的作用

2.1 氧化應(yīng)激的主要特點(diǎn) 氧化應(yīng)激(oxidative stress)是一種細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成增加與(或)ROS生成減少的失衡狀態(tài)[2]。這兩種情況中任何一種條件失衡都可能造成氧化應(yīng)激。最常見(jiàn)的ROS成分包括超氧陰離子、次氯酸及其鹽、脂質(zhì)過(guò)氧化物等。在這一進(jìn)程中ROS以及活性氮(RNS)受到氧化損傷、線粒體損傷、免疫調(diào)控等刺激連續(xù)產(chǎn)生[1，17]。ROS本身就是正常的氧化代謝環(huán)節(jié)中產(chǎn)生的副反應(yīng)物，但是在應(yīng)激情況下，ROS可能的生成遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了機(jī)體正常代謝的水平，從而過(guò)多的ROS會(huì)引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成損傷[18]。細(xì)胞線粒體是主要產(chǎn)生ROS的場(chǎng)所，線粒體也是細(xì)胞內(nèi)通過(guò)復(fù)雜的氧化磷酸化途徑給細(xì)胞功能產(chǎn)生ATP的部位，故ROS的過(guò)量產(chǎn)生勢(shì)必會(huì)損傷線粒體的正常功能，最終影響細(xì)胞能量代謝。過(guò)量的ROS造成細(xì)胞的損傷，故氧化應(yīng)激一直是研究項(xiàng)目中的熱點(diǎn)，許多疾病包括心腦血管病、癌癥、慢性代謝性疾病等都已證實(shí)有氧化損傷參與了其發(fā)生發(fā)展的一系列過(guò)程[19]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)因?yàn)槠洫?dú)特的高代謝性、高ATP要求及抗氧化損傷能力的相對(duì)較小，故神經(jīng)細(xì)胞是氧化損傷發(fā)生的一個(gè)重災(zāi)區(qū)[20]。上文已經(jīng)說(shuō)到ROS能損傷大分子物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，故氧自由基尤其是超氧陰離子自由基等是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要損傷離子，脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物如丙二醛(MDA)等物質(zhì)會(huì)積累在細(xì)胞中，故可以利用MDA含量的檢測(cè)來(lái)間接反映氧化損傷的程度。目前被認(rèn)可的大分子氧化應(yīng)激標(biāo)志物有MDA、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)等。一邊是氧化損傷造成的大分子氧化物生成，另一邊機(jī)體就會(huì)利用內(nèi)源的手段去阻止這種氧化損傷的進(jìn)一步進(jìn)行，細(xì)胞會(huì)消耗抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)、NADPH等酶[21]。除此之外飲食因素也有助于細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷，像食物中的維生素(C族和E族)、胡蘿卜素、多酚等物質(zhì)也具有抗氧化性[22]。除了飲食以外，生活環(huán)境因素同樣對(duì)生物體內(nèi)抵御氧化損傷有幫助，例如，很大一部分取決于生活方式、體育鍛煉、吸煙習(xí)慣等等諸多因素，這些細(xì)胞內(nèi)外的條件綜合決定著人類(lèi)抗氧化損傷能力的強(qiáng)弱或者氧化應(yīng)激發(fā)生的概率[23]。最后基于基因組學(xué)等各項(xiàng)新方法的研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤中存在著明顯的氧化應(yīng)激異常，ROS可以攻擊遺傳物質(zhì)、故遺傳物質(zhì)的損傷很容易出現(xiàn)原癌基因與抑癌基因的突變[24,25]。

2.2 缺血性腦卒中氧化應(yīng)激異常 雖然目前普遍認(rèn)為ROS造成的氧化損傷是諸多疾病及生理環(huán)境失衡的根本，但是也有不一樣的聲音。Gems和Partridge[26]就認(rèn)為低度的氧化損傷不僅不會(huì)造成細(xì)胞受損，反而會(huì)使細(xì)胞具有抵御高危險(xiǎn)損傷的能力。如果我們可以人工干預(yù)細(xì)胞應(yīng)對(duì)ROS的氧化應(yīng)激，那就很有可能改變各種與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的預(yù)后。前面已經(jīng)提到神經(jīng)細(xì)胞因?yàn)槠洫?dú)特的生理特性，故面對(duì)缺血缺氧誘導(dǎo)的氧化損傷更加敏感。缺血缺氧誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生可能有如下原因：缺血缺氧直接誘導(dǎo)、炎性細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)可以產(chǎn)生自由基[27]。另外，氧自由基攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)，造成細(xì)胞膜損壞，胞膜通透性增加、Ca離子內(nèi)流[28]，同時(shí)增加的離子紊亂擾亂線粒體內(nèi)能量代謝，鈣泵、鈉泵被抑制，氧化磷酸化途徑被阻滯，最后細(xì)胞ATP供應(yīng)不足而死亡[29]。

在缺血性腦卒中患者身上發(fā)現(xiàn)氧化的血清白蛋白增加，這可能與ROS氧化氨基酸殘基有關(guān)[30]，這提示了ROS在缺血性腦卒中扮演了重要的作用。正常條件下，腦內(nèi)通過(guò)一系列抗氧化酶來(lái)防止ROS的過(guò)量產(chǎn)生，將自由基維持在一個(gè)健康的水平，這些內(nèi)源性酶如SOD、GPX、CAT再加上外援的小分子抗氧化劑(維生素C/E等)共同構(gòu)建腦內(nèi)氧化與抗氧化的平衡。在急性缺血性腦卒中患者血液里大多數(shù)抗氧化劑(維生素C/E)都有明顯的下降[31]，這說(shuō)明了在缺血性腦卒中患者體內(nèi)發(fā)生了劇烈的抗氧化反應(yīng)。當(dāng)這一內(nèi)源性抗氧化酶加外源性抗氧化小分子無(wú)法阻止ROS的繼續(xù)生成，神經(jīng)細(xì)胞受損的一系列癥狀就開(kāi)始逐漸發(fā)生，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA的氧化受損等，最終都導(dǎo)致一個(gè)結(jié)局神經(jīng)細(xì)胞死亡，炎性反應(yīng)啟動(dòng)，同時(shí)炎性反應(yīng)又可以繼續(xù)激活ROS生成，形成一個(gè)惡性循環(huán)。故有效的制止氧化損傷是缺血性腦卒中治療的一個(gè)關(guān)鍵步驟。目前有一些公認(rèn)ROS清除劑被廣泛運(yùn)用于臨床或者科研，像NAC、維生素E、依達(dá)拉奉等藥物。依達(dá)拉奉在數(shù)個(gè)臨床試驗(yàn)中都被證明了可以減少缺血性腦卒中的缺血灶，同時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證明減輕了血腦屏障的損傷[32]。盡管在抗ROS實(shí)驗(yàn)中我們有許多藥物被不斷地發(fā)現(xiàn)，但是實(shí)際運(yùn)用臨床，包括依達(dá)拉奉在內(nèi)的許多藥物依然表現(xiàn)不佳[33]。這提示我們ROS在缺血性腦卒中里發(fā)揮的機(jī)制并不是我們目前所知道的那么簡(jiǎn)單，這其中可能還有更深層次的關(guān)系等待去研究。

3 自噬與氧化應(yīng)激的交互

在缺血缺氧的動(dòng)物模型中都已經(jīng)觀察到了自噬與氧化損傷的激活，但是既往的實(shí)驗(yàn)很少把這兩種機(jī)制聯(lián)合起來(lái)研究，在ROS激活的線粒體損傷中，自噬是會(huì)隨之激活促進(jìn)受損的線粒體分解，保護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[34]。雖然自噬在神經(jīng)元死亡過(guò)程中究竟如何發(fā)揮作用仍然未知。已經(jīng)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ROS導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量失衡時(shí)會(huì)活化AMPK通路[35]，然后通過(guò)復(fù)雜的AMPK-TSC1-TSC2-RHEB 調(diào)控，最終抑制mTOR 蛋白促進(jìn)自噬激活[36]。同時(shí)新的發(fā)現(xiàn)提示神經(jīng)元軸突富含線粒體，也是ROS產(chǎn)生的主要部位，在軸突的急性損傷中，線粒體內(nèi)大量ROS可以通過(guò)PARK2/PARKIN激活線粒體自噬[37]。不僅僅是針對(duì)缺血性腦卒中，在帕金森這樣的退行性疾病進(jìn)程中同樣涉及到ROS誘導(dǎo)Parkin/PINK 1依賴(lài)的線粒體自噬的啟動(dòng)[38]。

研究發(fā)現(xiàn)ROS中的H2O2及超氧負(fù)離子主要承擔(dān)調(diào)控自噬的作用[39]，當(dāng)這兩種自由基明顯升高后，就會(huì)通過(guò)一種穩(wěn)定的刺激經(jīng)P13K-Akt通路抑制自噬，但這種抑制作用可以通過(guò)阻滯Akt或MTROC 1來(lái)重新激活[40]。盡管目前自噬對(duì)細(xì)胞生存還是死亡的影響尚不清楚。

除了ROS可以調(diào)控自噬通路以外，自噬也可以調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激。細(xì)胞通過(guò)自噬降解衰老或損傷的線粒體，減少ROS的產(chǎn)生。機(jī)體內(nèi)最重要的抗氧化通路Keap 1/Nrf2/Are在抵抗ROS誘導(dǎo)損傷中起著決定性作用，當(dāng)收到氧化應(yīng)激時(shí)，Keap 1與Nrf2解耦聯(lián)，活化Nrf2,起到抗氧化損傷的作用，但如果ROS過(guò)度產(chǎn)生，超過(guò)細(xì)胞正常調(diào)節(jié)能力，Nrf2則會(huì)受到抑制。P62作為自噬底物，也可以調(diào)控Keap 1/Nrf2/Are通路，磷酸化的P62可以增加與Keap 1結(jié)合的活力，而Keap 1失去了與Nrf2結(jié)合的機(jī)會(huì)，多出來(lái)的Nrf2可以入核調(diào)控ARE抗氧化元件[41]。這再次說(shuō)明了自噬與抗氧化調(diào)節(jié)在細(xì)胞內(nèi)的相輔相成。

綜上所述，氧化應(yīng)激和自噬在多種生理或病理情況下發(fā)揮著各自的作用，之前的研究由于觀點(diǎn)的不清楚，大多數(shù)沒(méi)有把它們二者綜合考慮，但隨著人們理解的進(jìn)一步深入，這兩者之間相互聯(lián)系的關(guān)系逐漸浮出水面。這無(wú)疑為大多數(shù)疾病的病理生理提供了新的理解。越來(lái)越多的研究將目光放在了自噬與氧化損傷的共同作用，并且發(fā)現(xiàn)這種綜合考慮的治療方案同樣在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)上取得好的結(jié)果[42]。這也大大鼓舞了下一步研究方向的展開(kāi)。未來(lái)的研究應(yīng)該從ROS產(chǎn)生的機(jī)制入手，阻止ROS的過(guò)度生成，這可能會(huì)帶來(lái)更好的療效。另一方面，自噬在大多數(shù)疾病中的雙重作用也有待去深入研究，但毋庸置疑的一點(diǎn)是，自噬與氧化應(yīng)激是一個(gè)整體，只有在綜合考慮下才可能找到治療缺血性卒中、神經(jīng)退行性疾病的更好方案。