染色體微陣列分析技術在759例不同產前診斷指征孕婦羊水中的臨床應用分析

劉軼，劉艷，李毅，劉娜，楊慶慧，牟凱*

(1.淄博市婦幼保健院遺傳病實驗室，淄博 255000；2.山東省東營市利津縣中心醫院，東營 257400；3.杭州甄元醫學檢驗實驗室，杭州 310007)

染色體是人類的遺傳物質，染色體疾病是導致人類出生缺陷的重要原因之一，且目前尚無有效的治療方法，只能依靠產前診斷達到預防染色體疾病的目的。胎兒染色體核型分析是診斷胎兒染色體疾病的金標準，但傳統的核型分析技術只能檢出≥10 Mb的染色體結構異常[1]。隨著技術的發展，染色體微陣列分析技術(CMA)在臨床上應用越來越廣泛，已被推薦為產前超聲異常胎兒遺傳學檢測的首選診斷方法[2-3]，可用于檢測人類染色體微重復或微缺失引起的各種疾病，是染色體核型分析的有效補充[4]。CMA技術平臺根據設計原理的不同可以分為比較基因組雜交微陣列芯片(CGH array)和單核苷酸多態性微陣列芯片(SNP array)[5]，本研究的檢測結果均來自SNP array檢測。CMA在產前診斷領域應用的臨床指征主要有高齡、血清學篩查高風險、B超異常、無創產前DNA檢測(NIPT)高風險、夫妻一方染色體異常、不良孕產史等。對于如何準確把握B超檢查中的軟指標，可能是困惑臨床醫生的主要問題之一。本研究通過分析CMA在不同臨床指征的異常檢出情況，向產前診斷臨床醫生提供參考依據，指導準確把握穿刺指征，為降低出生缺陷，提高人口素質做貢獻。

材料與方法

一、研究對象

選取2016年1月至2019年9月在我院行介入性產前診斷的孕婦759例，所有孕婦均簽署產前診斷知情同意書；每例入組孕婦均按照標準流程在無菌條件下抽取羊水并送實驗室檢測。

二、方法

排除介入性穿刺禁忌癥后，在超聲引導下行羊膜腔穿刺術抽取30 ml羊水，其中10 ml用于CMA檢測，20 ml用于核型分析。

1.核型分析：抽取20 ml羊水，1 500 轉/min離心10 min，收集羊水細胞行常規培養。細胞培養結束后，對羊水細胞進行常規染色體的制備，G顯帶，鏡檢30個中期分裂相，分析5個核型。診斷標準參考2016年人類細胞遺傳學國際命名體系(ISCN)。

2.CMA：對抽取的10 ml羊水使用基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取gDNA，經過SNP-Array 750K芯片(Affymetrix，美國)檢測(包括gDNA消化、連接、PCR擴增、DNA片段化、生物素標記、芯片雜交、芯片洗滌染色和掃描等)，結合Chromosome Analysis Suite(ChAS)3.2分析軟件和國際常用的公共數據庫(DECIPHER、OMIM、ClinGen、PubMed、UCSC、DGV)評估染色體是否存在非整倍體異常、整倍體異常、微缺失/微重復異常、雜合性缺失異常等。

三、CMA檢測結果的主要判讀原則

在25 Marker探針的分辨率水平對樣本進行分析，報告致病變異、可能致病變異和臨床意義未明變異(VOUS)。不報告小于500 kb重復及小于200 kb缺失的臨床意義未明片段；不報告基因組染色體中已知屬于正常多態變化的片段?；虿糠秩笔Щ蚧騼戎貜涂赡軐е禄虍惓?、提示3 Mb以上的雜合性缺失片段、對于判讀為VOUS的異常片段，一般建議結合父母驗證明確異常來源，提高報告咨詢的準確性。

四、數據統計

利用EXCEL表格統計分析759例產前羊水樣本的SNP-Array檢測結果，采用計數和頻率描述統計結果。

結 果

一、染色體異常病例的CMA檢出率分析

759例羊水中共檢出126例異常病例，包含致病性變異和可能致病性變異，共占16.6%；其中發現常染色體數目異常病例21例，常染色體雜合性缺失病例1例，性染色體數目異常病例56例，致病性片段異常病例48例。在致病性片段異常病例中，小片段異常(<10 Mb)病例40例，占總樣本數量的5.3%(表1)。

表1 CMA檢出的染色體異常類型分析(n=126)

二、核型分析與CMA檢出染色體異常病例的對比分析

CMA檢出的125例異常病例中(去掉1例雜合性缺失病例)，染色體非整倍體異常77例，核型分析與CMA檢出一致；致病性片段異常CMA檢出48例，核型分析檢出8例，CMA較核型分析多檢出40例致病性小片段異常(表2)。

表2 125例染色體異常病例的對比分析

三、CMA在不同羊水穿刺指征中的染色體異常檢出率分析

根據羊水穿刺指征可分為高齡、血清學篩查高風險、B超異常、NIPT高風險、夫妻一方染色體異常、不良孕產史(包括夫婦曾生育過染色體異?；純?，夫婦本身不存在染色體異常)和其他(包括孕期服藥、孕婦要求和特殊環境下工作等)共7個部分。統計分析發現CMA診斷率最高的產前診斷指征為NIPT高風險，共檢出異常病例78例，檢出率為28.9%；其次為B超異常，共檢出異常病例43例，檢出率12.5%；CMA診斷率最低的產前診斷指征是血清學篩查高風險，沒有確診病例檢出(表3)。

表3 CMA在不同產前診斷指征中的染色體異常分析

四、不同B超指征患者的CMA異常檢出率分析

759例產前羊水中，B超異常指征共有344例。其中包含2個及2個以上B超異常指征的多系統異常病例106例，CMA檢出異常病例18例，檢出率達17.0%；單一B超異常指征的病例238例，CMA檢出異常病例25例，檢出率達10.5%。在不區分B超多系統異常和單系統異常的情況下進行常見B超異常指征分類，統計分析發現腦部異常(21.7%)、腸管異常(21.4%)和胎兒頸部透明帶(NT)異常(20.9%)的CMA檢出率較高，羊水偏少和胎兒生長異常沒有異常病例檢出(表4)。

表4 不同B超指征患者(n=344)的CMA異常檢出率分析

五、染色體拷貝數變異(CNV)的妊娠結局分析

從2016年1月至2018年10月，共隨訪260例病例。在隨訪病例中，非整倍體異常病例40例，占比15.4%，其中引產30例、正?；町a10例(均為性染色體異常病例)；致病性CNV異常病例13例，占比5.0%，其中自然流產1例、引產9例、正?；町a3例；臨床意義未明CNV(VOUS)異常病例39例，占比15.0%，其中引產5例、正常活產30例、胎死宮內1例、出生異常3例；檢測正常病例168例，占比64.6%，其中引產12例、早產9例、出生異常4例、正?；町a143例(表5)。

表5 260例隨訪病例的妊娠結局分析[n(%)]

討 論

一、CMA在產前診斷中的應用價值

染色體異常包括染色體數目異常和染色體結構異常，臨床上常見的染色體疾病包括21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、Turner綜合征、克氏綜合征、超雌綜合征、超雄綜合征等[6]。CMA可穩定檢出<10 Mb的小片段CNV，是核型分析的有效補充，對于檢出有染色體疾病的胎兒，在明確異常來源的前提下既可以避免缺陷兒的出生，又可以進行再發風險的評估，指導生育。本研究的結果顯示CMA檢出40例片段大小<10 Mb的致病性異常，相較于傳統的核型分析(≥10 Mb)可多檢出5.3%的染色體異常胎兒，有助于降低出生缺陷，提高人口素質。

CMA在產前診斷方面的臨床應用指證中B超異常樣本數量占比最高，達到45.3%，對于孕期發現胎兒B超檢測異常的病例，實現染色體非整倍體或CNV異常的明確診斷是非常有臨床意義的。本研究的結果顯示在B超異常人群中CMA檢出17例片段大小<10 Mb的致病性異常片段，相較于傳統的核型分析(≥10 Mb)可多檢測出2.2%的染色體異常胎兒，染色體異常檢出率提高了約65.4%。與相關的研究結果類似，在以B超異常為主的產前診斷中，CMA可明顯提升染色體疾病的檢出率[7-8]。正如2013年美國婦產科學會(ACOG)所建議的，當胎兒存在超聲異常并需要行介入性產前診斷時，推薦使用CMA檢測，且可以替代傳統的核型分析[2]。不過，目前國內相關的臨床數據不足，需要積累更多的數據，進一步證實CMA在產前診斷中的應用價值。

二、CMA檢測結果分類及存在的遺傳咨詢壓力

美國醫學遺傳學學會(ACMG)和臨床基因組資源(ClinGen)在2019年聯合發表的文章中將CNV結果分為致病性CNV、可能致病性CNV、臨床意義未明CNV、可能良性CNV和良性CNV五種類型[9]。其中臨床意義未明CNV又稱VOUS，是指不明確檢出CNV的致病性[10]，有研究報道VOUS占比不高于5.0%[11-12]，本研究中VOUS總占比為18.2%，高于其他報道，為減輕遺傳咨詢壓力，建議通過實時結合新指南調整報告閾值標準[13]以及打通父母驗證通路完善本地數據庫等方式降低VOUS檢出率。

產前診斷受限于有限的臨床信息導致很難解釋CNV的臨床相關性，致使一些臨床意義未明的CNV給孕婦造成巨大的精神壓力，這些都給臨床一線工作者帶來很大的挑戰[14]。在對260隨訪病例的統計發現，妊娠結局正常的案例中有16.1%(30/186)為臨床意義未明病例；妊娠結局異常的案例中有12.2%(9/74)為臨床意義未明病例，從統計數據可以看出，檢出臨床意義未明的病例存在不同的妊娠結局，因此，遺傳咨詢關系到胎兒的去留，為至關重要的環節，需慎重處理。此外，本研究還發現妊娠結局異常的案例中有33.8%(25/74)為檢測正常病例，提示染色體異常等遺傳因素僅是胎兒缺陷的主要原因(66.2%)，還有其它原因也會導致胎兒畸形，如感染、輻射、致畸物質、孕婦慢性病等環境因素。

三、結論與展望

本研究統計分析了759例產前樣本的CMA檢測情況，結果表明CMA不僅可檢出與核型分析一致的非整倍體和大片段CNV異常(≥10 Mb)；還可在傳統核型分析的基礎上，檢出小片CNV異常(<10 Mb)，將胎兒染色體異常檢出率提高5.3%，是確診胎兒染色體疾病不可替代的檢查方法。但任何技術都存在其局限性，如CMA無法檢測染色體平衡性重排[15]；核型分析雖可以發現大片段的染色體平衡性重排，但分辨率較低；NIPT檢測陽性率雖然較高，但亦存在其局限性，不能取代血清學篩查以及羊膜腔穿刺術[16]。因此，多種技術聯合應用可以為醫生提供更客觀全面的臨床信息，提出更合理的建議，讓孕婦做出最合適的選擇，進而為降低出生缺陷做出貢獻。

本研究由于樣本量有限，部分結果可能與現有報道存在一定的差異，為進一步提高數據的可信度，未來需要統計更多的臨床病例或者開展多中心合作。