心理應激對小鼠卵母細胞氧化應激水平及凋亡因子的影響

馬瑞紅，程蕊，劉妍，夏天

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300193)

隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活節(jié)奏的日益加快，女性在社會與家庭中承擔了更多的責任，背負著巨大的壓力，易受應激源的刺激從而產生心理應激。心理應激可干擾下丘腦-垂體-卵巢軸、下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-甲狀腺軸，從而引起性激素、皮質類固醇激素及甲狀腺素的變化[1]，導致生殖內分泌功能紊亂，嚴重損害女性的生殖功能[2]，甚至導致不孕。本課題組以現(xiàn)代“心理應激”理論為基礎，前期研究發(fā)現(xiàn)心理應激使小鼠血清活性氧簇(ROS)濃度升高，損傷卵巢組織的抗氧化系統(tǒng)，降低卵巢組織內抗氧化酶含量，從而損害卵巢功能[3]。為進一步探析心理應激導致女性生殖功能下降的病因學及發(fā)病機制，本研究擬驗證心理應激是否損傷小鼠卵母細胞的抗氧化系統(tǒng)、是否損害卵母細胞功能及促進卵母細胞凋亡，進而導致不孕癥的發(fā)生，以期為心理應激降低女性生殖功能提供新的科學實驗數(shù)據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物及材料

1.實驗動物：SPF級4～5周齡ICR未孕雌性小鼠80只，體重20～26 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證編號：SCXK(京)2019-0002]。小鼠在人工控制環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，光照時間12 h，室溫24℃。動物購入后適應性喂養(yǎng) 1～2 d后納入實驗。

2.主要試劑：孕馬血清促性腺激素(PMSG)、HCG購于北京索萊寶科技有限公司，M2培養(yǎng)基、透明質酸酶購于美國Sigma公司，活性氧(ROS)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，TRIZOL一步法RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)，Anti-actin、Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-Caspase-3和Anti-Cytochrome C均為抗兔單克隆體(Cell Signaling Technology，美國)，SuperScript III RT反轉錄試劑盒(ABI-invitrogen，美國)，Sybr qPCR Mix(ABI-invitrogen，美國)。

3.主要儀器：體視顯微鏡(Nikon，日本)、熒光酶標儀(Molecular Devices，美國)、qPCR儀(Applied biosystems，美國)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國)。

二、研究方法

1.實驗分組及心理刺激實驗：將80只ICR雌性小鼠隨機分為4組，分別為正常組、心理應激強刺激組、心理應激中刺激組和心理應激弱刺激組，給予各心理應激組小鼠不同程度且不可預知性刺激(具體制備過程詳見文章[3])，心理應激強刺激組：每天給予2次不同的刺激；心理應激中刺激組：每天給予1次不同的刺激；心理應激弱刺激組：隔天給予1次不同的刺激；同時選取不給予任何干預的正常小鼠為正常組。心理應激組小鼠連續(xù)刺激6周，并通過刺激前后小鼠體重、刺激后曠場試驗及糖水偏好指數(shù)，證實心理應激小鼠模型制備成功[3]。

2.卵母細胞收集：建模后各組小鼠在動情前期腹腔注射PMSG 7.5 U，46 h后腹腔注射HCG 7.5 U，16 h后頸椎脫臼快速處死小鼠，用75%乙醇消毒腹部，分別在輸卵管和卵巢之間靠近輸卵管的子宮部剪開，將斷離的輸卵管放入小玻璃皿中的M2培養(yǎng)液中。另一側輸卵管重復同樣操作。在體視顯微鏡下，左手用鑷子按壓一端，右手用針尖劃開輸卵管膨大的壺腹部，使卵丘-卵母細胞復合體(COCs)溢出，用提前拉好的口吸管將COCs從M2培養(yǎng)液轉移到0.1%透明質酸酶的液滴中，37℃消化30 s～1 min，脫去顆粒細胞，待卵團自然分散成單個細胞，開始清洗，用口吸管把卵母細胞在M2培養(yǎng)液中轉移3次，洗去顆粒細胞和透明質酸酶，備用。

3.ROS濃度檢測：采用DCFH-DA探針進行小鼠卵母細胞內ROS濃度的測定，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，去除培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA，以能充分蓋住細胞為宜。將不加探針，只加培養(yǎng)液的卵母細胞設為陰性對照管；陽性對照管用加入探針的卵母細胞，同時加入活性氧供氫體誘導細胞。37℃孵育細胞30～60 min，吸去培養(yǎng)液，用PBS反復吹打，肉眼觀察瓶底由半透明轉為透明，細胞層幾乎全部吹打至PBS中，將細胞懸液全部收集到1.5 ml EP管中，用PBS洗滌2次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，1 200 g，離心5 min，吸凈上清加入PBS重新懸浮細胞，用熒光酶標儀在500 nm波長下測定ROS吸光度。

4.RT-PCR：收集卵母細胞于離心管中，用Trizol法按照試劑盒步驟提取RNA后測濃度，并反轉為cDNA備用。應用RT-PCR法測定卵母細胞內SOD2、CAT、GSH-Px抗氧化酶和Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-3凋亡因子mRNA水平的相對表達情況，根據(jù)目的基因分別設計合成引物，引物序列見表1。擴增反應條件：95℃變性2 min，94℃退火20 s，60℃延伸 20 s，72℃ 30 s(40個循環(huán))擴增完畢后，根據(jù)CT值(目標擴增產物達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，以β-actin為內參照基因。

表1 引物序列

5.Western blot：取對數(shù)生長期卵母細胞，吸出培養(yǎng)液，PBS洗后收集于離心管中，加入1 ml PBS重懸細胞，500g離心5 min，加入5倍體積的裂解液，混勻，冰浴中以最大功率超聲破碎細胞3次，每次10 s，4℃，13 000g離心15 min。上清BCA法測定蛋白濃度，用蛋白上樣緩沖液將蛋白定量為5 mg/ml。制備SDS-PAGE 10%分離膠、5%濃縮膠。把樣本加至凝膠孔中，每孔上樣10 μl。凝膠電泳完畢后，轉膜，將蛋白條帶轉印至PVDF膜，封閉，將一抗工作液(1∶1 000)加入封閉后的膜中，4℃反應過夜，用1×TBST洗滌4次，之后放入配置好的二抗工作液(1∶2 000)中，搖床孵育1 h，1×TBST洗膜，洗去游離二抗，按1∶1(v/v)混合ECL試劑盒中兩種液體，將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面，室溫作用4 min。抖掉膜上液體，將其放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。以Actin為內參蛋白，計算目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、各組小鼠卵母細胞內的ROS濃度

各心理應激刺激組小鼠卵母細胞內ROS濃度均顯著高于正常組(P<0.05)；進一步兩兩比較顯示，隨著刺激強度的增加小鼠卵母細胞內ROS濃度逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

注：組間相互比較，*P<0.05

二、各組小鼠卵母細胞內SOD2、CAT和GSH-Px 的mRNA表達水平

各心理應激刺激組小鼠卵母細胞內抗氧化酶SOD2、CAT和GSH-Px的mRNA表達水平均顯著低于正常組(P<0.05)；進一步兩兩比較顯示，隨著刺激強度的增加，小鼠卵母細胞內SOD2、CAT和GSH-PxmRNA表達水平逐漸降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

注：組間相互比較，*P<0.05

三、各組小鼠卵母細胞內凋亡相關因子的mRNA表達水平比較

各心理應激刺激組小鼠卵母細胞內Bcl-2基因表達水平均顯著低于正常組(P<0.05)，進一步兩兩比較顯示，隨著刺激強度的增加，小鼠卵母細胞內Bcl-2基因表達水平逐漸降低，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；心理應激各刺激組小鼠卵母細胞內Bax、CytC和Caspase-3基因表達水平均顯著高于正常組(P<0.05)，進一步兩兩比較顯示，隨著刺激強度的增加，小鼠卵母細胞內Bax、CytC和Caspase-3基因表達水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

注：組間相互比較，*P<0.05

四、各組小鼠卵母細胞內凋亡相關蛋白表達情況比較

各心理應激刺激組小鼠卵母細胞內Bcl-2表達水平均顯著低于正常組(P<0.05)；Bax、CytC和Caspase-3蛋白表達水平均顯著高于正常組(P<0.05)；進一步兩兩組間比較顯示，隨著刺激強度的增加小鼠卵母細胞內Bcl-2表達水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著刺激強度的增加小鼠卵母細胞內Bax和Caspase-3蛋白表達水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；強刺激組與弱刺激組CytC蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

A：Western Blot；B～E：灰度分析柱狀圖；注：組間相互比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05

討 論

隨著社會的快速發(fā)展及女性對自身價值的完美追求，諸多因素給現(xiàn)代女性帶來了巨大的心理壓力，使女性持續(xù)處于應激狀態(tài)，嚴重影響其生殖功能。氧化應激(OS)是導致不孕的重要因素，其不但能夠誘導卵母細胞的退化和凋亡，還可以致使胚胎DNA損傷以及基因突變[4]。OS使氧化產物增加的同時降低了抗氧化酶的活性[5]。氧的某些代謝物和衍生物主要以超氧自由基(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)3種類型存在，被統(tǒng)稱為ROS[6]。正常情況下，ROS的產生和清除可以保持動態(tài)平衡，當ROS產生增加和(或)細胞的抗氧化功能受損，機體不能及時有效清除時ROS則會累積，其與脫氧核糖核酸、蛋白質和脂質相互作用，致使細胞OS損傷[7-8]。哺乳動物的卵母細胞與胚胎內部清除ROS的抗氧化物系統(tǒng)是由酶性以及非酶性系統(tǒng)共同調節(jié)的。酶性抗氧化物主要有SOD、GSH-Px和CAT等。

SOD催化超氧化物歧化成氧和(過氧化氫)H2O2，然后通過CAT將H2O2轉化為氧和水，從而達到對抗OS的目的[9]。SOD家族內包括SOD1、SOD2和SOD33種抗氧化酶，且這三者都能夠清除超氧化物陰離子，因此SOD家族在抗氧化過程中起重要作用[10]。SOD2位于線粒體中，是清除細胞內ROS最主要的抗氧化酶。CAT主要存在于機體內的細胞器中，它通過催化分解H2O2使其發(fā)生反應生成完全無害的水和氧氣來發(fā)揮自身的抗氧化作用，而其催化分解H2O2則主要是通過細胞內的三羧酸循環(huán)來完成的[11]。GSH-Px通過參與還原型谷胱甘肽(GSH)的氧化還原循環(huán)，一起將脂質過氧化產物轉化為無毒產物，從而保護細胞膜和線粒體的完整性。

細胞凋亡是一種細胞程序性死亡的過程，受基因控制，對生物發(fā)育和維護體內平衡有重大意義[12-13]。在一定的細胞凋亡信號傳導下，線粒體外膜釋放可溶性血蛋白Bax、CytC、AIF、內切酶G等膜間空間蛋白，不可逆激活下游Caspase促進細胞凋亡過程[14]。Bcl-2家族蛋白通過調控線粒體功能和CytC的釋放從而在細胞凋亡中起重要作用，Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞凋亡程度[15-16]。Bax是Bcl-2家族中最早被發(fā)現(xiàn)的促凋亡因子，調控釋放CytC并激活Caspase促進細胞凋亡。當機體處于應激環(huán)境中，CytC從線粒體釋放入細胞質與Apaf-1結合形成凋亡小體，誘導Caspase級聯(lián)反應而導致細胞凋亡[17]。正常情況下，Caspase-3以無活性的酶原形式存在于細胞質中，當細胞凋亡信號出現(xiàn)后，不同細胞凋亡途徑誘發(fā)的各類蛋白水解酶可分別切割并激活Caspase-3，被激活的Caspase-3通過剪切Caspase底物而引起級聯(lián)反應并最終導致細胞凋亡[18]。本實驗中隨著心理應激刺激強度的增強，小鼠卵母細胞內抑凋亡相關因子Bcl-2水平逐漸降低，促凋亡相關因子Bax、CytC、Caspase-3水平逐漸升高，說明心理應激可促進小鼠卵母細胞的凋亡，且心理應激程度越強小鼠卵母細胞凋亡程度越顯著。本實驗中各心理刺激組比正常組小鼠卵母細胞內ROS水平顯著升高(P<0.05)，SOD2、CAT和GSH-PxmRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，表示抗氧化酶活性降低使其不足以清除卵母細胞內過量累積的ROS，最終導致OS從而損傷卵母細胞質量和功能。

課題組前期試驗證實了心理應激能夠激發(fā)小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)，抑制下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)，影響小鼠內分泌及卵巢儲備功能導致卵泡發(fā)育異常[19]；長期處于慢性心理應激狀態(tài)導致小鼠體內ROS累積，損傷卵巢組織的抗氧化系統(tǒng)，降低卵巢組織內抗氧化酶含量，從而損害卵巢功能[3]。在以上研究結論的基礎上，本實驗進一步探討心理應激對小鼠卵母細胞氧化應激水平及凋亡因子的影響。本研究結果證實了心理應激可引發(fā)卵母細胞內OS反應，損傷卵母細胞的抗氧化系統(tǒng)，促進卵母細胞的凋亡，希望可以提醒生殖醫(yī)學專家在臨床治療中重視心理應激對女性不孕癥患者的影響，關注患者的負面情緒，對心理負擔重的患者主動進行心理疏導，注重心理干預和心理治療，給予她們全方位、多角度的支持和人文關懷，并倡導育齡期女性平時要關注情志調節(jié)，注重心理健康。