miR-9-5p調控雄激素受體的表達促進卵巢顆粒細胞增殖

王芳，楊麗華，余柯達，何健英，鄒立波

(金華市人民醫院生殖中心，金華 321000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種女性最常見的內分泌失調疾病，影響大約5%～10%育齡婦女[1-2]。PCOS主要以高雄激素血癥、慢性無排卵和多囊卵巢為主要臨床表現，并常伴有痤瘡、脫發、皮脂溢、肥胖、多毛癥和棘皮癥等[3]。當前越來越多的研究發現，卵巢顆粒細胞(KGN)的異常增殖與PCOS的形成有密切關系[4-5]。因此，探究KGN增殖潛在的調控機理將為PCOS的治療提供新的方案。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類高度保守的小型非編碼RNA，通過與目標mRNA 3’-非編碼區(3’-UTR)互補配對，在轉錄后水平上調節基因轉錄和翻譯[6]。先前已有大量研究證明，異常表達的miRNAs與人類多種疾病的病理過程有關，包括腫瘤、炎癥性疾病、代謝性疾病及PCOS等[7]。當前研究者已發現數十種miRNAs通過調控KGN增殖而在PCOS形成中發揮重要作用，如miR-19b[8]、miR-27a-3p[9]、miR-145[10]及miR-320a[11]等。但是，關于miR-9-5p在PCOS中的研究尚未見諸報道。本研究旨在比較miR-9-5p在PCOS患者及健康女性血清中的表達特征，分析在PCOS中的診斷價值，并探討對KGN增殖的作用及機制。

資料與方法

一、實驗材料

1.研究對象：收集2018年1月至2019年10月于金華市人民醫院生殖中心就診的50例PCOS患者為實驗組，以體檢科進行健康體檢的50例健康女性為對照組。所有參與者要求年齡為18～35歲。實驗組納入標準[12]：(1)閉經或少經(每年<8個月經周期)；(2)臨床或生化檢查提示高雄激素血癥，臨床高雄激素血癥[13]診斷標準：多毛癥，且Ferriman-Gallwey評分≥3；生化高雄激素血癥[14]：根據正常月經的健康女性的睪酮水平，將總睪酮水平或游離睪酮水平定為高于第95個百分點(總睪酮>67 ng/dl或游離睪酮>0.84 ng/dl)。對照組為月經正常、卵巢功能正常、無高雄激素血癥的女性。所有參與者排除標準：先天性腎上腺皮質增生癥，庫欣綜合征，過去3個月內服用過藥物(類固醇、避孕藥、二甲雙胍或噻嗪類利尿劑等)。

本研究經金華市人民醫院倫理委員會批準通過，所有參與者均簽署知情同意書。

2.主要試劑及儀器：Trizol與Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，美國)，反轉錄及熒光定量試劑盒(QIAGEN，德國)，PCR引物(上海生工生物工程)，DMEM培養基、FBS與雙抗(Thermo Fisher Scientific，美國)，miR-9-5p拮抗劑(antagomir)與陰性對照(antagomir control)(蘇州吉瑪基因)，MTT與DMSO(Sigma-Aldrich，美國)，雙重熒光素酶報告基因分析系統(Promega，美國)，兔抗人單克隆AR抗體(ab108341)、兔抗人單克隆GAPDH抗體(ab181602)及山羊抗兔HRP二抗(ab6721)均購自英國Abcam，。全自動生化測試儀(BK-1200#，濟南博科生物)，熒光定量PCR儀(7500HT/FAST#，ABI，美國)，酶標儀(680#，BIO-RAD，美國)，二氧化碳細胞培養箱(MCO-18AC#，SANYO，日本)，流式細胞儀(CytoFLEX#，Beckman，德國)。

二、研究方法

1.生化檢測：測量所有參與者的身高和體重，并計算體質指數(BMI)。通過化學發光免疫法測量睪酮(T)水平，通過葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)水平，通過放射免疫法測定空腹胰島素(fasting serum insulin，FINS)及黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)及抗苗勒管激素(AMH)水平。

2.RNA提取和qRT-PCR：從所有參與者肘前區域采集5 ml全血樣品，部分分離血清并置于-80℃保存。按照試劑說明，從剩余全血樣品中提取總RNA，并反轉錄合成cDNA。根據實時定量PCR試劑盒說明書配制反應體系，反應條件：95℃ 150 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。以小核U6基因作為miR-9-5p的內參，進行PCR反應。miR-9-5p引物序列：上游引物5′-CGAGCTCTGTGTGTGTGTGTGTGTG-3′，下游引物5′-TTCCGCGGCCGCTATGGCCGAGGAA-3′；U6引物序列：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt法計算miR-9-5p的相對表達量[15]。

3.細胞培養：KGN購自日本茨城縣理研生物資源中心，培養于含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養箱中培養。

4.細胞轉染：細胞實驗設計為3組，分別為空白組、antagomir control及antagomir組。空白組細胞不進行轉染，而antagomir control及antagomir組細胞分別轉染antagomir control及antagomir。具體操作如下：轉染前一天，將KGN以2×105/孔的密度接種到6孔板中。使用Lipofectamine 2000試劑分別按照說明書進行antagomir和antagomir control的轉染。將轉染后的KGN在37℃、5%CO2的條件下培養48 h，收集細胞用于qRT-PCR檢測。

5.MTT：將KGN以6×103/孔的濃度接種在96孔板中，并用antagomir和antagomir control進行轉染。轉染后24、48、72 h，將20 μl MTT(5 mg/ml)添加到每個孔中，并再孵育4 h。然后通過離心(1 000g×5 min，室溫)棄去上清液，并向每個孔中加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)以溶解結晶。使用ELx808酶標儀測量每孔在490 nm波長的吸光度(OD)。

6.流式細胞儀檢測：將轉染后的KGN細胞接種在6孔板中，并培養48 h后，用PBS洗滌兩次并重懸。然后向細胞中加入70%的冷乙醇，混合后在4℃下孵育過夜。第二天離心收集細胞，在黑暗條件下向每個樣品中添加2 μl RNA酶(RNase)和300 μl碘化丙啶(PI)染料溶液，混合并在室溫和黑暗環境中孵育30 min。通過流式細胞儀檢測各樣品的細胞周期。

7.熒光素酶報告基因實驗：通過PCR擴增含野生型或突變型miR-9-5p結合位點的AR mRNA 3′-UTR的部分片段，并將其克隆到pMIR載體的螢火蟲報告基因的下游，產生重組載體AR-wt和AR-mut。使用Lipofectamine 2000試劑將構建的重組載體AR-wt和AR-mut與antagomir和antagomir control共轉染到KGN中。轉染后48 h，使用Promega公司提供的雙重熒光素酶報告基因分析系統測定熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為對照標準化各樣品的螢火蟲熒光素酶活性。

8.Western Blotting：按照蛋白裂解液RIPA說明書，提取處理后KGN的總蛋白，將30 μg總蛋白質收集在上樣緩沖液中，12%SDS-PAGE電泳分離，隨之轉移到PVDF膜上。將膜與5%的牛奶封閉30 min，然后與抗AR(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶2 500稀釋)抗體在4℃下孵育過夜，并采用TBS-T緩沖液洗滌3次，每次5 min。將膜與過氧化物酶偶聯的二抗(1∶3 000稀釋)在室溫下孵育1 h，并采用TBS-T緩沖液洗滌3次，每次5 min。使用Bio-rad ChemiDoc MP Imaging系統檢測蛋白條帶，并利用Image Lab 軟件分析各條帶的光密度。

三、統計學分析

結 果

一、兩組研究對象的一般臨床資料和內分泌參數比較

兩組研究對象的年齡及BMI差異均無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，實驗組血清中T、FPG、FINS、LH及AMH水平均顯著升高，而FSH水平則顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 兩組一般資料和內分泌參數比較

二、miR-9-5p在PCOS患者血清中表達特征及診斷價值

調整年齡和BMI后，miR-9-5p在實驗組和對照組血清中的相對表達水平分別為(0.037±0.018)和(0.022±0.014)，差異有統計學意義(t=6.51，P<0.001)(圖1A)。ROC曲線顯示，miR-9-5p在診斷PCOS中AUC為0.76，敏感性為65.43%，特異性為74.09%(P<0.001)(圖1B)。

A：兩組血清中miR-9-5p的表達水平；B：miR-9-5p 診斷PCOS的ROC曲線。與對照組比較，***P<0.001

三、轉染antagomir后KGN細胞中miR-9-5p的表達水平變化

與空白組相比，KGN細胞轉染antagomir和antagomir control 24 h后，細胞內可見大量紅色熒光蛋白表達，表明轉染效果良好(圖2A)。空白組、antagomir control及antagomir組中miR-9-5p的相對表達水平分別為(1.0±0.21)、(1.05±0.16)及(0.17±0.19)，組間比較具有顯著性差異(F=29.29，P<0.001)。與空白組和antagomir control組相比，antagomir組中miR-9-5p的表達水平顯著降低(P<0.001)(圖2B)。

A：KGN轉染效果鑒定；B：miR-9-5p在各組KGN內的表達情況。與空白組及antagomir control組比較，***P<0.001

四、miR-9-5p對KGN增殖能力的影響

MTT法檢測轉染后KGN在不同時間段增殖情況，結果顯示，空白組細胞在0、24、48及72 hOD值分別為(0.24±0.025)、(0.40±0.032)、(0.76±0.058)及(0.95±0.077)；antagomir control組細胞在0、24、48及72 h OD值分別為(0.24±0.025)、(0.38±0.029)、(0.77±0.049)及(0.91±0.073)；antagomir組細胞在0、24、48及72 h OD值分別為(0.24±0.025)、(0.31±0.034)、(0.65±0.051)及(0.79±0.066)，組間比較有顯著性差異(F=11.85，P<0.001)。與空白組、antagomir control組相比，antagomir組細胞在24、48、72 h增殖能力顯著降低(P<0.001)(圖3A)。空白組細胞在G0/G1、S及G2/M期的比例分別為(48.56±5.78)、(27.44±3.26)、(24.0±3.09)；antagomir control組細胞在G0/G1、S及G2/M期的比例分別為(50.0±6.44)、(26.18±3.97)、(23.82±2.60)；antagomir組細胞在G0/G1、S及G2/M期的比例分別為(61.23±7.48)、(16.68±2.05)、(22.09±3.72)，組間比較差異有顯著性(F=5.91，P=0.003)。與空白組及antagomir control組相比，antagomir組細胞中G0/G1期比例增加，而S期細胞比例減少(P<0.001)(圖3B)。

A：轉染后KGN在不同時間段增殖情況(MTT法)；B：轉染后KGN細胞周期的變化與空白組及antagomir control組比較，***P<0.001

五、miR-9-5p靶基因的預測驗證

采用TargetScan Human 7.2數據庫預測miR-9-5p的靶基因，發現AR mRNA 3’-UTR中“ACCAAAG”序列與miR-9-5p中“UGGUUUC”種子序列完全互補配對，提示AR可能為miR-9-5p靶基因(圖4A)。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，當轉染重組載體AR-wt后，空白、antagomir control及antagomir組相對熒光素酶活性分別為(1.0±0.18)、(1.13±0.20)、(3.65±0.69)，組間比較有顯著性差異(F=31.60，P<0.001)。與空白及antagomir control組相比，antagomir組中相對熒光素酶活性升高(P<0.001)(圖4B)。

當轉染重組載體AR-mut后，空白、antagomir control及antagomir組相對熒光素酶活性分別為(1.0±0.11)、(1.04±0.15)、(0.95±0.23)，3組比較無顯著性差異(F=1.78，P=0.52)(圖4B)。WB結果顯示，空白、antagomir control及antagomir組細胞中AR蛋白的表達水平分別為(1.0±0.13)、(0.92±0.08)、(6.44±0.71)，3組比較有顯著性差異(F=43.41，P<0.001)。與空白及antagomir control組相比，antagomir組細胞中AR蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)(圖4C)。

A：AR mRNA 3’-UTR與miR-9-5p的結合位點預測；B：熒光素酶報告基因實驗結果；C：WB分析AR蛋白的表達水平變化。與空白及antagomir control組比較，***P<0.001

討 論

PCOS是一種代謝與內分泌異常疾病，是女性不育的重要原因之一[1]。近幾十年來，盡管研究者做了大量關于PCOS的相關探究，但該病發生的確切原因尚不清楚。由于雌激素對子宮內膜組織的長期刺激，PCOS患者可增加腫瘤的患病風險[16]。因此完全有必要系統地探索PCOS的發病機理，并為其治療提供新的方案。miRNAs是一種小分子RNA，在進化中高度保守，參與人體的正常生長、代謝和發育，在多種生理過程中也起著關鍵作用[6]。近年來研究發現，miRNAs在多種疾病狀態下異常表達，并被認為是疾病的重要治療靶點[17]。目前，已發現許多miRNAs在PCOS中表達上調或下調，并參與PCOS的病理形成過程[18]。例如，miR-324在PCOS患者卵巢組織和KGN中表達顯著下調，過表達miR-324通過誘導凋亡而抑制KGN細胞活力[19]。低表達的miR-16在PCOS中促進顆粒細胞增殖并抑制凋亡，miR-125b亦可調節PCOS中KGN增殖[20]。另一項研究報道，miR-483在PCOS患者中表達下調并降低KGN增殖[21]。本研究評估了患有PCOS血清中miR-9-5p的表達水平，特別是矯正了患者的年齡和BMI，并發現miR-9-5p在PCOS患者血清中表達上調。更為重要的是，我們發現干擾miR-9-5p通過抑制細胞周期G1到S期的轉變而抑制KGN增殖，提示miR-9-5p具有促進KGN增殖的作用。

在人類基因組中，miR-9從三個獨立的基因組位點轉錄分別映射到染色體1q22(miR-9-1)、5q14.3(miR-9-2)和15q26.1(miR-9-3)，這些轉錄本最終產生了功能成熟的miR-9-5p。越來越多的證據表明，miR-9-5p通過調控細胞增殖而影響腫瘤的發生發展[22]。此外，Wang等[23]發現血清miR-9-5p表達與細胞因子和趨化因子水平顯著相關，可作為類風濕關節炎的無創性生物標志物。Ylmaz等[24]報道血清中miR-9-5p表達下調與阿爾茨海默氏病患病風險增加顯著相關。S?rensen等[25]發現腦脊液中miR-9-5p可能是新的急性缺血性腦卒中診斷標志物。近年來，研究者亦發現一些miRNAs可作為新的診斷PCOS的分子標志物。Jiang等[26]發現血清miR-21可能提示PCOS進展，并可以作為新型診斷PCOS的無創性生物標志物。Song等[27]證實血清miR-6767-5p是新型診斷PCOS的分子生物學標志物，并且可能參與PCOS代謝。本研究采用ROC曲線發現血清miR-9-5p表達對PCOS的診斷具有較高的特異度及敏感度，提示miR-9-5p可能是一種新的PCOS診斷標志物。正如前面報道的一樣，本研究不僅證實了miR-9-5p在PCOS中異常表達，并為PCOS診斷標志物提供了新的成員。

越來越多的報告表明，miRNAs可以與靶基因的3′-UTR結合并在轉錄后水平上調節基因表達。由于雄激素作用通過AR介導，因此AR介導的作用與PCOS的發生密切相關。動物模型研究顯示，AR的全身治療可誘發PCOS樣臨床特征；而使用AR拮抗劑氟他胺治療可恢復某些PCOS患者的正常排卵，并在PCOS小鼠模型中挽救無懷孕和類似焦慮的行為[28]。此外，AR信號缺失可保護雌性小鼠免于產前高雄激素血癥引起的PCOS[29]。據報道，AR是前列腺癌和膀胱癌中miR-381[30]和miR-449a[31]的直接靶標。此外，越來越多的研究表明，AR在卵巢KGN異常增殖中起著重要作用[32]。與上述結果一致，我們的研究進一步證明AR是KGN細胞中miR-9-5p的直接靶標，miR-9-5p可直接與AR mRNA 3’-UTR互補結合而降低KGN中AR蛋白的表達水平。該結果表明，miR-9-5p通過直接調控AR而促進KGN增殖進而影響PCOS的發生發展。

綜上所述，本研究發現miR-9-5p在PCOS患者血清中表達上調，推測可能是一種新的PCOS診斷標志物。在機制上，miR-9-5p通過直接調控AR而促進KGN增殖。