抗心磷脂抗體陽性復發性流產小鼠胎盤的差異蛋白組學研究

謝雅貞，陸啟濱

(1.南京中醫藥大學太倉附屬醫院，太倉 215400；2.江蘇省中醫院，南京 210029)

復發性自然流產(Recurrent Spontaneous Abortion，RSA)是指與同一性伴侶連續2次或2次以上在妊娠20周內的胎兒丟失，是流產類的疑難病，其發病率有逐年上升趨勢，嚴重危害婦女的生殖及心理健康[1]。研究表明，大約1%～3%正常生育的健康婦女和超過15%的RSA患者抗心磷脂抗體(Anticardiolipin antibody，ACA)陽性[2-4]。抗磷脂抗體是一組針對各種帶負電荷磷脂的自身抗體的總稱，其中以心磷脂抗體(ACA)最具代表性，它的靶抗原是存在于細胞膜和線粒體膜中帶負電荷的心磷脂，為甘油磷脂類結構。病理狀態下這類磷脂分布到細胞膜外，當其與血清中的β2-糖蛋白1型結合后即暴露出抗原位點，誘導產生相應的自身抗體，即抗β2-糖蛋白1抗體[2-4]。ACA陽性患者體外受精率、妊娠率、著床率均明顯下降，流產風險極高[2-4]。因此，ACA 所致的RSA在國內外引起了廣泛關注，但目前對于其發生機制的認識仍然不足。近年來，基于宏觀角度的蛋白組學和基因組學等組學分析成為研究疾病發生機制的重要方法，通過分析組間差異蛋白，可為探索疾病發生機制提供線索[5-7]。本研究應用非標記定量蛋白質組技術分析ACA陽性復發性流產小鼠胎盤組織中蛋白表達譜特征并進行生物信息學分析，為下一步探討ACA陽性復發性流產的發病機制和篩選治療靶點提供參考依據。

材料和方法

一、研究材料

1.實驗動物：雄性和雌性BALB/c小鼠(SPF級)各20只，雌性8周齡，體重25±2 g，雄性8～10周齡，體重30±2 g。小鼠由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供(動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，合格證號：No.201902211)。SPF級標準全營養飼料由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。

2.主要試劑和儀器：人β2GPI，購自ProSpec公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo Fisher公司；小鼠ACA ELISA試劑盒，購自上海聯碩生物科技有限公司；RIPA裂解液購自碧云天生物科技有限公司；抗體HIF-1α(14179)、TLR4(14358)、TSP-1(37879)、Tim-3(83882)、RORγt(16540)和β-actin(5174)均為兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(sc-2004，Santa Cruz，美國)。Eppendorf AG 22331 Hamburg冷凍離心機(Eppendorf，美國)，SpectraMax M2多功能酶標儀(Molecular Devices Corporation，美國)，ChemDoc XRS凝膠成像系統(Bio-rad，美國)，UV-2450型紫外分光光度計(島津，日本)，ESI-MS/MS LTQ-Velos高分辨質譜儀(Thermo Fisher，美國)。

二、研究方法

1.小鼠模型建立：將雌性實驗小鼠適應性喂養2 d后隨機分為2組：正常對照組和模型組，每組10只。人β2-糖蛋白I(β2-GPI)用無菌PBS調整濃度為400 μg/ml。模型組第1天腹腔注射人β2-GPI溶液與完全弗氏佐劑(CFA)混合液50 μl(1∶1比例)，第8天注射人β2-GPI與不完全弗氏佐劑(IFA)混合液50 μl(1∶1比例)，正常對照組在相應時間點注射生理鹽水50 μl；至第18天兩組雌性小鼠與雄性小鼠1∶1合籠，自合籠之日起，每天8：00和14：00點分別觀察一次，以見到陰栓為妊娠第0天。

2.動物處理及組織、血清收集：在妊娠第15天時，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，頸動脈采血，2 000g離心15 min取上清，-80℃保存備用。采血后頸椎脫臼法處死孕鼠，取胎盤、胎鼠進行稱重，取出子宮，記錄吸收胎個數和存活胎個數。胚胎吸收率按以下公式計算：胚胎吸收率=吸收胎個數/(吸收胎個數+存活胎個數)×100%。血清、胎盤中ACA含量按照ELISA試劑盒操作說明進行。

3.蛋白樣品收集處理：按組織樣品：裂解液=10 mg∶80 μl的比例，加入RIPA強裂解液，用剪刀剪碎組織，使用組織破碎儀破碎組織(中強度，每次轉3 s，停3 s，重復3次)，于冰上放置15 min后，12 000g4℃離心15 min，取上清于-80℃保存備用。

4.蛋白凝膠電泳分離：樣品濃度測定參考BCA法。每個樣品取25 μg，采用12% SDS-PAGE 進行分離；分離后的凝膠采用考馬斯亮蘭染色法進行染色，染色后的凝膠Image Scanner 掃描儀進行掃描。

5.差異蛋白質組學分析：每組取3只小鼠的胎盤組織進行Label-free蛋白組學分析，蛋白還原烷基化、酶解及LC-MS/MS上機檢測和蛋白搜庫由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

6.生物信息學分析：生信分析數據處理主要用Python軟件。利用R語言ggplot2軟件包和pheatmap軟件包分別繪制差異蛋白的火山圖和聚類熱圖，利用Gene Ontology數據庫進行GO富集分析，分析差異蛋白的細胞成分、分子功能及生物學過程；利用KEGG pathway對差異蛋白富集的信號通路進行功能注釋分析，通過StringDB蛋白質互作數據庫進行蛋白相互作用網絡分析。

7.差異蛋白的Western Blot驗證：蛋白上樣量為40 μg，12%SDS-PAGE，100 V恒壓 1 h，濕轉法電轉移到PVDF膜(95 mA，75 min)，用含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，加入HIF-1αTLR4TSP-1 Tim-3RORγtβ-actin一抗抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，含0.5%Tween 20的TBS洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶3 000稀釋)，37℃孵育2 h，洗膜同上，加ECL發光顯色液，室溫反應2 min后于暗室曝光。采用Image J軟件處理western blot條帶，分析各組條帶灰度，計算與內參蛋白β-actin比值。

三、統計學處理

結 果

一、ACA陽性流產模型小鼠與正常對照小鼠的胚胎大體結果

本文成功構建ACA陽性流產小鼠模型。與正常對照組相比，模型組胎鼠重量、胎盤重量顯著下降(P<0.05)；胚胎丟失率、血清和胎盤中ACA含量均顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 兩組小鼠胚胎大體差異比較

二、兩組小鼠胎盤組織蛋白的SDS-PAGE的分離結果

正常對照組和ACA模型組各取3只小鼠提取胎盤組織蛋白進行 SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍染色后顯示，兩組樣品的蛋白質遷移帶清晰，平行度較好，符合后續實驗要求(圖1)。

M：Marker；1-3：正常對照組；4-6：ACA模型組

三、兩組小鼠胎盤組織差異蛋白的鑒定和篩選

通過非標記定量技術質譜分析，獲得的二級質譜圖總數為585 740，鑒定到的肽段數目為40 331，蛋白數為4 338，部分肽段質譜圖如圖2。以差異倍數大于或等于1.5 倍(上調或下調)且P值(T-test檢驗)<0.05作為標準，與正常對照組相比，ACA模型組小鼠胎盤組織中顯著上調的蛋白數為35，顯著下調的蛋白數為52。差異蛋白火山圖如圖3A所示，差異蛋白熱圖如圖3B所示。

圖2 部分肽段質譜圖

圖3 差異蛋白火山圖(A)和聚類熱圖(B)

四、GO富集分析

GO富集分析結果顯示，差異蛋白質在生物學過程方面主要與定位和跨膜轉運有關；細胞組分方面主要位于細胞外區；分子功能方面主要參與跨膜轉運活性調控(圖4)。

圖4 GO富集柱狀圖

五、KEGG通路富集分析

據富集結果，繪制富集到的KEGG通路的氣泡圖(只展示前20的結果)(圖5)，KEGG通路富集分析結果顯示：差異蛋白質主要在代謝通路和磷脂酶D信號通路富集。

圖5 KEGG富集氣泡圖

六、差異蛋白相互作用分析

利用String DB蛋白質互作數據庫(http：//string-db.org/)進行鑒定蛋白的相互作用分析，39個差異蛋白之間存在相互作用(圖6)。

紅點代表上調蛋白，藍點代表下調蛋白

七、差異蛋白的Western blot驗證

選取已報道與RSA發生發展有關的低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR-4)、凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)以及維甲酸相關孤核受體γt(Retineic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma，RORγt)進行Western blot驗證。結果顯示，ACA模型組小鼠胎盤組織中HIF-1α、TLR-4、TSP-1、Tim-3和RORγt 蛋白表達量顯著上升(P<0.05)(圖6)，與質譜分析結果一致。

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

合理可靠的動物模型是疾病發病機制研究的重要基礎。研究表明采用β2-GPI主動免疫法可建造穩定可靠的ACA陽性流產小鼠模型，β2-GPI注射入體內，打破了體內的免疫耐受，促使機體產生β2-GPI抗體，形成抗原抗體復合物促使血液凝固，形成血栓，促使血管內皮受到破壞，暴露磷脂結合位點，誘導產生ACA[8-9]。β2-GPI主動免疫法優點主要包括：(1)與其它造模方法相比，此法更接近ACA形成的生理過程；(2)成功率高、模型穩定；(3)操作簡單、耗時短、可避免其它因素的干擾[8-9]。本實驗給予雌性小鼠β2-GPI后，孕鼠的胎鼠重量及胎盤重量均顯著降低，胚胎丟失率顯著升高，血清和胎盤ACA濃度顯著升高。提示造模成功，為下一步的實驗奠定了基礎。

非標記定量蛋白質組學技術是蛋白質組學研究的重要內容。通過比較研究對象在生理、病理或外界條件刺激下蛋白質的表達情況，來了解生物的調控機制[10]。近年來，非標記定量蛋白質組學技術已成為疾病發病機制相關研究中蛋白質表達、定性和定量分析的強有力工具[7，11]。本研究利用非標記定量蛋白質組學技術，在ACA陽性小鼠胎盤組織中共鑒定出87個差異蛋白，其中35個顯著上調，52個顯著下調。GO富集分析結果顯示，差異蛋白主要定位于細胞外，參與跨膜轉運活性調控。KEGG富集結果表明，差異蛋白主要與代謝和磷脂酶D信號通路有關。蛋白質相互作用網絡分析顯示，差異蛋白中有39個存在相互作用。這些生物信息學分析結果表明，差異蛋白可能通過這些途徑與病理生理過程參與ACA陽性流產的發生。

文獻分析發現差異蛋白中與RSA發生發展有關的主要包括：HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt。我們利用Western blot檢測HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt在兩組小鼠胎盤組織的表達，結果發現，與正常對照組相比，它們在ACA模型組中表達均升高，與蛋白組學結果相一致，提示本蛋白組學結果可信。HIF-1α在胎盤絨毛中的表達上調被證明與RSA有關[12]。研究表明TLR4在ACA陽性RSA發生、發展過程中發揮重要作用，可能是通過調控COX-2等細胞因子水平從而導致胚胎異常而引起病理妊娠，最終導致流產的發生[13]。李俠等[14]研究發現，TSP-1的異常表達可使胎盤的血液供應無法正常進行，影響胚胎發育，導致流產。大量研究發現Tim-3在RSA 的外周血和蛻膜組織中的高表達與RSA 的發生發展有關，RSA 患者血清中可溶性Tim-3(sTim-3)和Gal-9 表達增加，表明可溶性共刺激分子sTim-3 可能參與RSA 患者Th1和Th2 細胞的分化調控，使Th1/Th2 平衡偏向Th1，其機制可能為sTim-3與Gal-9 結合后削弱Tim-3/Gal-9 信號通路，傳遞抑制信號，從而參與RSA 的發生發展[15-18]。RORγt在母-胎界面表達上調影響Treg/Th17分化、生成，使免疫平衡向Th17細胞方向移動，從而破壞免疫耐受，導致RSA發生[19]。雖然如此，但有關HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt與ACA陽性RSA的關系及具體機制尚需進一步的研究明確。

總之，本研究用非標記定量蛋白質組技術揭示了ACA陽性流產小鼠胎盤組織中蛋白組學變化特征，初步分析了差異蛋白涉及的生物學功能和信號通路，為進一步探討ACA陽性流產的發病機制和篩選治療靶點提供線索。